本文選題：ALDH1 + 腫瘤干細胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2011年博士論文

【摘要】：研究背景與目的 干細胞(stem cells, SC)是一類具有自我復制能力(self-renewaling)的多潛能細胞,在一定條件下,它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段把干細胞分為胚胎干細胞(embryonic stem cells)和成體干細胞(progenitor somatic stem cells)。胚胎干細胞即全能干細胞,能分化成機體的所有細胞。成體干細胞(如血液干細胞、間充質(zhì)干細胞等)具有定向的分化功能和不對稱分裂的特性,一個子代細胞和母代完全一樣,另一個顯示組織分化的特點。干細胞因此獲得了自我更新、增殖及分化能力。 隨著對干細胞基礎理論研究與應用的不斷深入,人們設想腫瘤組織中可能存在一種極小量的腫瘤細胞,這類細胞具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能,是腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的根源,而其他的大多數(shù)腫瘤細胞并不具有這種能力；這一小部分細胞叫做腫瘤干細胞或腫瘤起始細胞(cancer stem cell、CSC, tumor initial cells、TIC)。最先證明存在的是白血病干細胞。在人急性髓性白血病(AML)患者中分離CD34+/CD38-表型的ALM細胞,將這類細胞接種于非肥胖型糖尿病/嚴重免疫缺血(non-diabetic/severe combined immunodeficiency, NOD/SCID)小鼠,可以產(chǎn)生類似人類的白血病,而CD34-/CD38+表型的白血病細胞卻不易形成腫瘤。近些年來,越來越多的實體瘤腫瘤干細胞的存在被得到證實。AI-Hajj等證明乳腺癌Lin-ESA+CD44+CD24-/low細胞比Lin-ESA-CD44+CD24-/low細胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的成瘤能力更強。Singh等發(fā)現(xiàn)僅用100個CD133+腦腫瘤細胞接種于NOD/SCID小鼠就可以形成腫瘤,且這些腫瘤細胞的表型及分化程度與原發(fā)腫瘤相似,而接種了(5-10)×104個CD133-腦腫瘤細胞的NOD/SCID小鼠只是在注射部位形成一條膠質(zhì)瘢痕。在其它實體腫瘤中如,黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部癌、大腸癌中也發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞。 正常干細胞和腫瘤干細胞均是非常稀少的一個亞群,這給相關研究工作帶來很大困難,如何分離和富集干細胞,是人們在一直關注的焦點。 關于鼻咽癌干細胞的研究已有一些報告,Zhang等利用Brdu標記滯留細胞證實鼻咽黏膜基底部有散在干細胞同時也發(fā)現(xiàn)了散在標記滯留細胞。BrdU標記的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)細胞株5-8F接種到裸鼠皮下,8周后也可發(fā)現(xiàn)散在標記滯留細胞。Wang等利用Hoechst 33342染料在鼻咽癌細胞株CNE2中分離出類似干細胞的側(cè)群細胞,且認為CK19是鼻咽癌干細胞標志物。到目前為止,鼻咽癌干細胞還沒有確切的標記物。雖然SP細胞可以富集鼻咽癌干細胞,但是有明顯局限性。所以尋找鼻咽癌干細胞確切的標記物對研究鼻咽癌干細胞具有重要意義。 乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1, ALDH1A1或RALDH 1)是乙醛脫氫酶(ALDH)家族之一,是催化細胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細胞溶質(zhì)酶。廣泛在正常組織的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中表達,也表達在免疫細胞中。人類的ALDH1基因表達存在于細胞質(zhì)中,其基因克隆和定位在9q2l染色體,由53×103個堿基對構(gòu)成,包含13個外顯子,共編碼501個氨基酸序列,無重復序列,N’端為蛋氨酸M (Met),具有一個谷氨酸(Glu)和一個半胱氨酸(Cys)激活位點,其基因啟動區(qū)包含一個ATA盒和一個CCAAT盒,分別位于轉(zhuǎn)錄起始部位上游的32 bp和74 bp處。最近學者們發(fā)現(xiàn)ALDH1可作為腫瘤干細胞的標記物。最先在造血細胞中發(fā)現(xiàn)ALDH1可作為腫瘤干細胞的標記物,在實體瘤中,2007年Ginestier等首次利用ALDH1為標記物在乳腺癌實體組織中發(fā)現(xiàn)了乳腺癌干細胞。ALDH1+乳腺癌細胞只占乳腺癌細胞總數(shù)的5%,但具有自我更新、少數(shù)細胞致瘤、多向分化的潛能。他們用ALDH1+細胞進行腫瘤形成實驗,只用500個ALDH1+細胞就能形成腫瘤,而即使用50000個ALDH1-細胞也不會形成腫瘤,說明ALDH1+細胞具有很高的致瘤能力。證明ALDH1是乳腺癌干細胞的標記物之一,并且還發(fā)現(xiàn)ALDH1也可作為乳腺癌臨床預后指標。隨后研究證明,ALDH1也可作為頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、眼癌、結(jié)直腸等實體瘤腫瘤干細胞的標記物。 ALDH1在鼻咽癌中的研究在國內(nèi)外還沒見報道,本實驗主要研究ALDH1的體內(nèi)外生物學功能以及與鼻咽癌患者臨床預后的關系。研究內(nèi)容與方法 1.鼻咽癌5-8F細胞株中ALDH1+細胞的體內(nèi)外生物學功能 1)ALDEFLUOR試劑分選5-8F細胞株中ALDH1+細胞和ALDH1-細胞 2)通過平板克隆形成實驗、MTT生長曲線法,比較ALDH1+細胞和ALDH1-細胞體外的自我更新與自我增殖能力。 3)Transwell實驗分析ALDH1+細胞和ALDH1-細胞的轉(zhuǎn)移能力。 4)腫瘤球形成實驗 培養(yǎng)基配方：無血清培養(yǎng)基DMEM-F12+EGF+bFGF+B27,ALDH1+細胞和ALDH1-細胞和未分選5-8F細胞以1000/ml的密度進行培養(yǎng),適時觀察Sphere形成數(shù)量和大小。 5)腫瘤球PKH26染色 6)免疫熒光檢測ALDH1在腫瘤球中表達 7)體內(nèi)成瘤實驗 5-8F細胞處于對數(shù)生長期時,胰酶消化、分選ALDH1+細胞和ALDH1-細胞,以500個、5000個、10000個、1×105個細胞分別注入SCID雙側(cè)腋下,觀察成瘤情況。6周后,取出瘤塊,固定、石蠟包埋并切片,HE染色,鏡下觀察結(jié)果。 8)熒光定量PCR檢測OCT4、BMI1、SOX2、KLF-4基因在ALDH1+細胞和ALDH1-細胞的mRNA表達水平 2.ALDH1+細胞與側(cè)群(SP)細胞關系的分析 1)流式細胞儀分選SP細胞和非SP細胞 2)免疫熒光檢測ALDH1在SP細胞和非SP細胞表達 3)流式細胞儀分選5-8F細胞株中ALDH1+細胞和ALDH1-細胞 4)免疫熒光檢測ABCG2在ALDH1+細胞和ALDH1-細胞的表達 5)熒光定量PCR檢測ALDH1在SP細胞和非SP細胞及ABCG2在ALDH1+細胞和ALDH1-細胞的表達 3.ALDH1與鼻咽癌患者臨床預后分析 免疫組化檢測ALDH1在122例鼻咽癌組織中的表達,用Kaplan-Meier法ALDH1的表達與鼻咽癌患者臨床預后的關系,同時COX回歸分析影響鼻咽癌患者臨床預后的風險因子。 4.ALDH1與上皮細胞—間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)關系的分析 1)免疫組織化學檢測E-cadherin.vimentin在鼻咽癌組織中的表達,spearman秩相關分析ALDH1與E-cadherin、vimentin的關系。 2)流式細胞儀分選5-8F細胞株中ALDH1+細胞和ALDH1-細胞 3)熒光定量PCR檢測在E-cadherin、vimentin在ALDH1+細胞和ALDH1-細胞的表達 4)免疫熒光檢測E-cadherin.vimentin在ALDH1+細胞和ALDH1-細胞的表達 結(jié)果 1.ALDH1的體內(nèi)外生物學功能 1)ALDH1+細胞占5-8F細胞的1.94%±0.69% 2)MTT生長曲線結(jié)果提示： 與ALDH1-細胞相比,ALDH1+細胞的增殖能力顯著增強,兩者具有差異具有統(tǒng)計學意義(F=154.333,P=0.000)。 3)平板克隆形成實驗結(jié)果提示：ALDH1+細胞體外培養(yǎng)其克隆形成率(53.500±2.784)%顯著多于ALDH1-細胞(27.667±2.843)%,兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=11.245,P=0.000)。與ALDH1-細胞相比,ALDH1+細胞體外自我更新,增殖能力更強。 4)體外遷移能力 Transwell遷移實驗：細胞培養(yǎng)16h后,ALDH1+細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)(94.000±9.615)顯著多于ALDH1-細胞(19.200±5.263),兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=15.826,P=0.000)。 5)形成腫瘤球的能力 ALDH1+細胞形成腫瘤球的能力顯著高于ALDH1-細胞和未分選的5-8F細胞(P=0.000),而未分選的5-8F細胞高于ALDH1-細胞(p=0.044),這說明ALDH1+細胞具有更強的自我更新,增殖能力。 6)腫瘤球PKH26染色 結(jié)果顯示,部分腫瘤球細胞被PKH26染上色,說明腫瘤球中部分細胞是腫瘤干細胞。 7)免疫熒光檢測ALDH1在腫瘤球中表達 結(jié)果顯示,ALDH1在腫瘤球中普遍表達。 8)SCID鼠體內(nèi)成瘤實驗 注射細胞總數(shù)分別為1×105,1×104,5000,500個ALDH1+細胞和ALDH1-細胞觀察6周,只要104個ALDH1+細胞就能形成腫瘤。而ALDH1-注射細胞數(shù)目1×105,觀察6周均未見瘤體形成。提示ALDH1+細胞較ALDH1-細胞有更強大的致瘤能力。 9)熒光定量PCR檢測ALDH1+細胞、ALDH1-細胞表達干細胞相關基因,結(jié)果顯示,OCT4(t=9.305,P=0.001),BMI 1(t=7.224,P=0.002), KLF4 (t=8.737,P=0.001),SOX2(t=10.309,P=0.000)在ALDH1+細胞中表達均高于ALDH1-細胞,差異具有統(tǒng)計學意義。 2.分析ALDH1與SP細胞的關系 1)熒光定量PCR檢測ALDH1在SP中的表達顯著高NSP細胞(t=8.925,P=0.001),同樣,ABCG2在ALDH1+細胞中的表達顯著高于ALDH1-細胞(t=11.044,P=0.000)。 2)免疫熒光的結(jié)果顯示,ALDHl在SP中高表達而在NSP細胞低表達,同樣,ABCG2在ALDH1+細胞中高表達而在ALDH1-細胞低表達。 3.ALDH1可作為鼻咽癌臨床預后的風險因子 免疫組織化學方法檢測ALDH1在122例鼻咽癌組織中的表達,結(jié)果顯示,ALDH1在鼻咽癌細胞中低表達,但在癌巢邊緣和間質(zhì)中,尤其是梭形細胞呈強陽性。通過Kaplan-Meier法分析了ALDH1的表達與鼻咽癌患者生存預后的關系,ALDH1的表達越高,中位生存時間越短；相反,表達越低,中位生存時間越長,提示ALDH1跟腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移由密切關系。COX回歸分析顯示,ALDH1是影響鼻咽癌患者臨床預后的獨立危險因素之一。 4.ALDH1與上皮細胞—間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)關系的分析 1)免疫組織化學方法檢測了在122例鼻咽癌組織中E-cadherin.Vimentin表達。結(jié)果顯示,E-cadherin在大部分鼻咽癌中表達較低,而Vimentin在大部分鼻咽癌中表達較高。spearman秩相關分析ALDH1表達與E-cadherin和Vimentin表達的關系,結(jié)果顯示,ALDH1表達與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.264,P=0.003)；而與Vimentin表達呈正相關(r=0.240,P=0.008)。 2)熒光定量PCR結(jié)果顯示,E-cadherin在ALDH1+細胞的表達低于在的達ALDH1-細胞(t=19.824,P=0.000)。相反,vimentin在ALDH1+細胞的表高于ALDH1-細胞(t=5.533,P=0.005)。 3)免疫熒光結(jié)果顯示,E-cadherin在ALDH1+細胞低表達,在ALDH1-細胞的高表達,相反,vimentin在ALDH1+細胞高表達,在ALDH1-細胞的低表達。 結(jié)論： 1。通過體外實驗提示ALDH1+細胞具有自我更新、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力；體內(nèi)實驗提示ALDH1+細胞具有很強的腫瘤形成能力。ALDH1+細胞具有腫瘤干細胞樣特性,可以作為鼻咽癌干細胞的功能性標記物。為以后研究鼻咽癌干細胞提供了一個平臺。 2.ALDH1+細胞和SP細胞存在交集。 3.ALDH1的表達與鼻咽癌的臨床預后相關,是影響鼻咽癌的臨床預后獨立風險因子之一,這對鼻咽癌患者臨床預后的評判提供了一條思路。 4.ALDH1+細胞具有上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的性質(zhì)。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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1 潘兆軍;江志敏;郭運杰;姚和瑞;;乙醛脫氫酶1在結(jié)腸癌組織中的表達及意義[J];中華普通外科學文獻(電子版);2009年01期

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本文編號：2034198