本文選題：ALDH1 + 腫瘤干細(xì)胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：研究背景與目的 干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewaling)的多潛能細(xì)胞,在一定條件下,它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段把干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells)和成體干細(xì)胞(progenitor somatic stem cells)。胚胎干細(xì)胞即全能干細(xì)胞,能分化成機(jī)體的所有細(xì)胞。成體干細(xì)胞(如血液干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等)具有定向的分化功能和不對(duì)稱分裂的特性,一個(gè)子代細(xì)胞和母代完全一樣,另一個(gè)顯示組織分化的特點(diǎn)。干細(xì)胞因此獲得了自我更新、增殖及分化能力。 隨著對(duì)干細(xì)胞基礎(chǔ)理論研究與應(yīng)用的不斷深入,人們?cè)O(shè)想腫瘤組織中可能存在一種極小量的腫瘤細(xì)胞,這類細(xì)胞具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能,是腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源,而其他的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞并不具有這種能力；這一小部分細(xì)胞叫做腫瘤干細(xì)胞或腫瘤起始細(xì)胞(cancer stem cell、CSC, tumor initial cells、TIC)。最先證明存在的是白血病干細(xì)胞。在人急性髓性白血病(AML)患者中分離CD34+/CD38-表型的ALM細(xì)胞,將這類細(xì)胞接種于非肥胖型糖尿病/嚴(yán)重免疫缺血(non-diabetic/severe combined immunodeficiency, NOD/SCID)小鼠,可以產(chǎn)生類似人類的白血病,而CD34-/CD38+表型的白血病細(xì)胞卻不易形成腫瘤。近些年來,越來越多的實(shí)體瘤腫瘤干細(xì)胞的存在被得到證實(shí)。AI-Hajj等證明乳腺癌Lin-ESA+CD44+CD24-/low細(xì)胞比Lin-ESA-CD44+CD24-/low細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的成瘤能力更強(qiáng)。Singh等發(fā)現(xiàn)僅用100個(gè)CD133+腦腫瘤細(xì)胞接種于NOD/SCID小鼠就可以形成腫瘤,且這些腫瘤細(xì)胞的表型及分化程度與原發(fā)腫瘤相似,而接種了(5-10)×104個(gè)CD133-腦腫瘤細(xì)胞的NOD/SCID小鼠只是在注射部位形成一條膠質(zhì)瘢痕。在其它實(shí)體腫瘤中如,黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部癌、大腸癌中也發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞。 正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞均是非常稀少的一個(gè)亞群,這給相關(guān)研究工作帶來很大困難,如何分離和富集干細(xì)胞,是人們?cè)谝恢标P(guān)注的焦點(diǎn)。 關(guān)于鼻咽癌干細(xì)胞的研究已有一些報(bào)告,Zhang等利用Brdu標(biāo)記滯留細(xì)胞證實(shí)鼻咽黏膜基底部有散在干細(xì)胞同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了散在標(biāo)記滯留細(xì)胞。BrdU標(biāo)記的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)細(xì)胞株5-8F接種到裸鼠皮下,8周后也可發(fā)現(xiàn)散在標(biāo)記滯留細(xì)胞。Wang等利用Hoechst 33342染料在鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中分離出類似干細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞,且認(rèn)為CK19是鼻咽癌干細(xì)胞標(biāo)志物。到目前為止,鼻咽癌干細(xì)胞還沒有確切的標(biāo)記物。雖然SP細(xì)胞可以富集鼻咽癌干細(xì)胞,但是有明顯局限性。所以尋找鼻咽癌干細(xì)胞確切的標(biāo)記物對(duì)研究鼻咽癌干細(xì)胞具有重要意義。 乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1, ALDH1A1或RALDH 1)是乙醛脫氫酶(ALDH)家族之一,是催化細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶。廣泛在正常組織的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中表達(dá),也表達(dá)在免疫細(xì)胞中。人類的ALDH1基因表達(dá)存在于細(xì)胞質(zhì)中,其基因克隆和定位在9q2l染色體,由53×103個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成,包含13個(gè)外顯子,共編碼501個(gè)氨基酸序列,無重復(fù)序列,N’端為蛋氨酸M (Met),具有一個(gè)谷氨酸(Glu)和一個(gè)半胱氨酸(Cys)激活位點(diǎn),其基因啟動(dòng)區(qū)包含一個(gè)ATA盒和一個(gè)CCAAT盒,分別位于轉(zhuǎn)錄起始部位上游的32 bp和74 bp處。最近學(xué)者們發(fā)現(xiàn)ALDH1可作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物。最先在造血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ALDH1可作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物,在實(shí)體瘤中,2007年Ginestier等首次利用ALDH1為標(biāo)記物在乳腺癌實(shí)體組織中發(fā)現(xiàn)了乳腺癌干細(xì)胞。ALDH1+乳腺癌細(xì)胞只占乳腺癌細(xì)胞總數(shù)的5%,但具有自我更新、少數(shù)細(xì)胞致瘤、多向分化的潛能。他們用ALDH1+細(xì)胞進(jìn)行腫瘤形成實(shí)驗(yàn),只用500個(gè)ALDH1+細(xì)胞就能形成腫瘤,而即使用50000個(gè)ALDH1-細(xì)胞也不會(huì)形成腫瘤,說明ALDH1+細(xì)胞具有很高的致瘤能力。證明ALDH1是乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物之一,并且還發(fā)現(xiàn)ALDH1也可作為乳腺癌臨床預(yù)后指標(biāo)。隨后研究證明,ALDH1也可作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、眼癌、結(jié)直腸等實(shí)體瘤腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物。 ALDH1在鼻咽癌中的研究在國(guó)內(nèi)外還沒見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)主要研究ALDH1的體內(nèi)外生物學(xué)功能以及與鼻咽癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。研究?jī)?nèi)容與方法 1.鼻咽癌5-8F細(xì)胞株中ALDH1+細(xì)胞的體內(nèi)外生物學(xué)功能 1)ALDEFLUOR試劑分選5-8F細(xì)胞株中ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞 2)通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT生長(zhǎng)曲線法,比較ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞體外的自我更新與自我增殖能力。 3)Transwell實(shí)驗(yàn)分析ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。 4)腫瘤球形成實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)基配方：無血清培養(yǎng)基DMEM-F12+EGF+bFGF+B27,ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞和未分選5-8F細(xì)胞以1000/ml的密度進(jìn)行培養(yǎng),適時(shí)觀察Sphere形成數(shù)量和大小。 5)腫瘤球PKH26染色 6)免疫熒光檢測(cè)ALDH1在腫瘤球中表達(dá) 7)體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 5-8F細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),胰酶消化、分選ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞,以500個(gè)、5000個(gè)、10000個(gè)、1×105個(gè)細(xì)胞分別注入SCID雙側(cè)腋下,觀察成瘤情況。6周后,取出瘤塊,固定、石蠟包埋并切片,HE染色,鏡下觀察結(jié)果。 8)熒光定量PCR檢測(cè)OCT4、BMI1、SOX2、KLF-4基因在ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平 2.ALDH1+細(xì)胞與側(cè)群(SP)細(xì)胞關(guān)系的分析 1)流式細(xì)胞儀分選SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞 2)免疫熒光檢測(cè)ALDH1在SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞表達(dá) 3)流式細(xì)胞儀分選5-8F細(xì)胞株中ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞 4)免疫熒光檢測(cè)ABCG2在ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞的表達(dá) 5)熒光定量PCR檢測(cè)ALDH1在SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞及ABCG2在ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞的表達(dá) 3.ALDH1與鼻咽癌患者臨床預(yù)后分析 免疫組化檢測(cè)ALDH1在122例鼻咽癌組織中的表達(dá),用Kaplan-Meier法ALDH1的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系,同時(shí)COX回歸分析影響鼻咽癌患者臨床預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因子。 4.ALDH1與上皮細(xì)胞—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)關(guān)系的分析 1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)E-cadherin.vimentin在鼻咽癌組織中的表達(dá),spearman秩相關(guān)分析ALDH1與E-cadherin、vimentin的關(guān)系。 2)流式細(xì)胞儀分選5-8F細(xì)胞株中ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞 3)熒光定量PCR檢測(cè)在E-cadherin、vimentin在ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞的表達(dá) 4)免疫熒光檢測(cè)E-cadherin.vimentin在ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞的表達(dá) 結(jié)果 1.ALDH1的體內(nèi)外生物學(xué)功能 1)ALDH1+細(xì)胞占5-8F細(xì)胞的1.94%±0.69% 2)MTT生長(zhǎng)曲線結(jié)果提示： 與ALDH1-細(xì)胞相比,ALDH1+細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng),兩者具有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=154.333,P=0.000)。 3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：ALDH1+細(xì)胞體外培養(yǎng)其克隆形成率(53.500±2.784)%顯著多于ALDH1-細(xì)胞(27.667±2.843)%,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.245,P=0.000)。與ALDH1-細(xì)胞相比,ALDH1+細(xì)胞體外自我更新,增殖能力更強(qiáng)。 4)體外遷移能力 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)16h后,ALDH1+細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)(94.000±9.615)顯著多于ALDH1-細(xì)胞(19.200±5.263),兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.826,P=0.000)。 5)形成腫瘤球的能力 ALDH1+細(xì)胞形成腫瘤球的能力顯著高于ALDH1-細(xì)胞和未分選的5-8F細(xì)胞(P=0.000),而未分選的5-8F細(xì)胞高于ALDH1-細(xì)胞(p=0.044),這說明ALDH1+細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新,增殖能力。 6)腫瘤球PKH26染色 結(jié)果顯示,部分腫瘤球細(xì)胞被PKH26染上色,說明腫瘤球中部分細(xì)胞是腫瘤干細(xì)胞。 7)免疫熒光檢測(cè)ALDH1在腫瘤球中表達(dá) 結(jié)果顯示,ALDH1在腫瘤球中普遍表達(dá)。 8)SCID鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 注射細(xì)胞總數(shù)分別為1×105,1×104,5000,500個(gè)ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞觀察6周,只要104個(gè)ALDH1+細(xì)胞就能形成腫瘤。而ALDH1-注射細(xì)胞數(shù)目1×105,觀察6周均未見瘤體形成。提示ALDH1+細(xì)胞較ALDH1-細(xì)胞有更強(qiáng)大的致瘤能力。 9)熒光定量PCR檢測(cè)ALDH1+細(xì)胞、ALDH1-細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因,結(jié)果顯示,OCT4(t=9.305,P=0.001),BMI 1(t=7.224,P=0.002), KLF4 (t=8.737,P=0.001),SOX2(t=10.309,P=0.000)在ALDH1+細(xì)胞中表達(dá)均高于ALDH1-細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.分析ALDH1與SP細(xì)胞的關(guān)系 1)熒光定量PCR檢測(cè)ALDH1在SP中的表達(dá)顯著高NSP細(xì)胞(t=8.925,P=0.001),同樣,ABCG2在ALDH1+細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于ALDH1-細(xì)胞(t=11.044,P=0.000)。 2)免疫熒光的結(jié)果顯示,ALDHl在SP中高表達(dá)而在NSP細(xì)胞低表達(dá),同樣,ABCG2在ALDH1+細(xì)胞中高表達(dá)而在ALDH1-細(xì)胞低表達(dá)。 3.ALDH1可作為鼻咽癌臨床預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因子 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ALDH1在122例鼻咽癌組織中的表達(dá),結(jié)果顯示,ALDH1在鼻咽癌細(xì)胞中低表達(dá),但在癌巢邊緣和間質(zhì)中,尤其是梭形細(xì)胞呈強(qiáng)陽性。通過Kaplan-Meier法分析了ALDH1的表達(dá)與鼻咽癌患者生存預(yù)后的關(guān)系,ALDH1的表達(dá)越高,中位生存時(shí)間越短；相反,表達(dá)越低,中位生存時(shí)間越長(zhǎng),提示ALDH1跟腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移由密切關(guān)系。COX回歸分析顯示,ALDH1是影響鼻咽癌患者臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。 4.ALDH1與上皮細(xì)胞—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)關(guān)系的分析 1)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了在122例鼻咽癌組織中E-cadherin.Vimentin表達(dá)。結(jié)果顯示,E-cadherin在大部分鼻咽癌中表達(dá)較低,而Vimentin在大部分鼻咽癌中表達(dá)較高。spearman秩相關(guān)分析ALDH1表達(dá)與E-cadherin和Vimentin表達(dá)的關(guān)系,結(jié)果顯示,ALDH1表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.264,P=0.003)；而與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.240,P=0.008)。 2)熒光定量PCR結(jié)果顯示,E-cadherin在ALDH1+細(xì)胞的表達(dá)低于在的達(dá)ALDH1-細(xì)胞(t=19.824,P=0.000)。相反,vimentin在ALDH1+細(xì)胞的表高于ALDH1-細(xì)胞(t=5.533,P=0.005)。 3)免疫熒光結(jié)果顯示,E-cadherin在ALDH1+細(xì)胞低表達(dá),在ALDH1-細(xì)胞的高表達(dá),相反,vimentin在ALDH1+細(xì)胞高表達(dá),在ALDH1-細(xì)胞的低表達(dá)。 結(jié)論： 1。通過體外實(shí)驗(yàn)提示ALDH1+細(xì)胞具有自我更新、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示ALDH1+細(xì)胞具有很強(qiáng)的腫瘤形成能力。ALDH1+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞樣特性,可以作為鼻咽癌干細(xì)胞的功能性標(biāo)記物。為以后研究鼻咽癌干細(xì)胞提供了一個(gè)平臺(tái)。 2.ALDH1+細(xì)胞和SP細(xì)胞存在交集。 3.ALDH1的表達(dá)與鼻咽癌的臨床預(yù)后相關(guān),是影響鼻咽癌的臨床預(yù)后獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子之一,這對(duì)鼻咽癌患者臨床預(yù)后的評(píng)判提供了一條思路。 4.ALDH1+細(xì)胞具有上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的性質(zhì)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 潘兆軍;江志敏;郭運(yùn)杰;姚和瑞;;乙醛脫氫酶1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義[J];中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版);2009年01期

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本文編號(hào)：2034197