本文選題：VEGF + SEMA3A��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】：目的： 研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子164(Vascular endothelial growth factorl64, VEGF164)和軸突坍塌導(dǎo)向因子(Semaphorin 3A, SEMA3A)在氧致視網(wǎng)膜病變大鼠(Oxygen induced retinopathy, OIR)視網(wǎng)膜中的表達(dá)變化,探討二者在視網(wǎng)膜中的作用及相互關(guān)系。 方法： 1.隨機(jī)選擇健康新生SD大鼠107只(214眼),隨機(jī)分為OIR組65只(130眼)和正常對(duì)照組42只(84眼)。OIR組每天交替給予氧濃度為50%和10%的氮氧混合氣,于生后(Posternatal day, P)14天出艙；正常對(duì)照組于正常氧環(huán)境下飼養(yǎng)。分別于P18、P24隨機(jī)取每組各4只(8眼),制作視網(wǎng)膜鋪片行ADP酶血管染色,計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜新生血管的時(shí)鐘位；于P12、P15、P18、P21和P24,隨機(jī)取每組各2只(4眼),制作石蠟切片行蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin,HE),計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。 2.隨機(jī)選擇OIR組和『正常對(duì)照組各24只(48眼),分別于P12、P15、P18和P24,各時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取4只大鼠,過(guò)量水合氯醛腹腔注射致死動(dòng)物后立即取眼球,左眼分離視網(wǎng)膜組織行RNA提取,real time PCR檢測(cè)VEGF164和SEMA3A的mRNA表達(dá)；右眼分離視網(wǎng)膜組織提取蛋白,Western Blot檢測(cè)VEGF164和SEMA3A的蛋白表達(dá)；于各時(shí)間點(diǎn)每組各取2只大鼠(3眼),制作冰凍切片,行視網(wǎng)膜組織VEGF164和SEMA3A免疫熒光染色檢查。 3.隨機(jī)選擇OIR組23只(46眼),于P12進(jìn)行玻璃體腔注射,左眼為VEGFab組,注入1ul含100ng的抗大鼠VEGF164抗體(anti- rat VEGF164 antibody, VEGFab) (R D公司,美國(guó))；右眼為IgG組,注入1ul含100ng無(wú)免疫活性的IgG (R D公司,美國(guó))。于P18和P24分別隨機(jī)選擇8只大鼠(16眼),于各時(shí)間點(diǎn)每組各取4眼行視網(wǎng)膜組織RNA提取,real time PCR檢測(cè)VEGF164和SEMA3A的mRNA表達(dá)；各4眼提取視網(wǎng)膜組織蛋白,Western Blot法檢測(cè)VEGF164和SEMA3A蛋白表達(dá)。隨機(jī)選擇7只(14眼),其中4只(8眼)于P18制作石蠟切片行HE染色,計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)；3只(6眼)制作冰凍切片,行視網(wǎng)膜組織VEGF164和SEMA3A免疫熒光染色。 4.在P18VEGFab組、IgG組、不進(jìn)行玻璃體腔注射OIR組以及正常對(duì)照組的冰凍切片中每組各選取3張,行TUNEL染色,觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層的細(xì)胞凋亡。選擇以上各組視網(wǎng)膜組織所提取的RNA, real time PCR檢測(cè)Bc1-2、Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),采用單因素方差分析及組間兩兩比較,以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.ADP酶血管染色顯示OIR大鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育遲滯并出現(xiàn)新生血管,P18為新生血管形成高峰期,P24血管改變基本消失。OIR組P18視網(wǎng)膜鋪片新生血管時(shí)鐘數(shù)為9.38±1.06個(gè),P24未發(fā)現(xiàn)新生血管叢。OIR組各時(shí)間點(diǎn)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯高于同日齡對(duì)照組,且以P18為最多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.292,P=0.000)。 2.OIR大鼠視網(wǎng)膜VEGF164和SEMA3A mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于正常大鼠。VEGF164和SEMA3A的mRNA表達(dá)變化在時(shí)空上具有一致性,但蛋白表達(dá)二者出現(xiàn)差別：VEGF164在生后15天出現(xiàn)高峰,而SEMA3A隨時(shí)間變化表達(dá)量呈增加的趨勢(shì)。免疫熒光結(jié)果顯示：VEGF164主要存在于視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層、外叢狀層、光感受器內(nèi)節(jié)；SEMA3A主要存在于外叢狀層和光感受器內(nèi)節(jié)、外節(jié)。OIR組視網(wǎng)膜中VEGF164和SEMA3A的熒光強(qiáng)度均高于正常對(duì)照組。 3. VEGFab玻璃體腔注射后,OIR大鼠視網(wǎng)膜VEGF164和SEMA3A mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降。免疫熒光顯示視網(wǎng)膜VEGF164和SEMA3A的熒光強(qiáng)度均下降。 4.P180IR組視網(wǎng)膜中Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào),TUNEL染色顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于正常對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。VEGFab玻璃體注射后,視網(wǎng)膜組織Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)下調(diào),Bcl-2表達(dá)上調(diào),視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和外核層凋亡細(xì)胞數(shù)低于IgG組,二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用氧濃度為50%和10%的氮氧混合氣體,成功誘導(dǎo)了大鼠OIR動(dòng)物模型,其視網(wǎng)膜新生血管形成高峰期為P18。 2.OIR大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF164和SEMA3A表達(dá)上調(diào),VEGFab玻璃體腔注射抑制VEGF164表達(dá)的同時(shí)SEMA3A表達(dá)下調(diào),VEGF164可能影響SEMA3A的表達(dá)。 3.OIR大鼠視網(wǎng)膜凋亡主要出現(xiàn)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層。VEGFab玻璃體腔注射后,視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡得到部分改善,推測(cè)VEGF164和SEMA3A可能共同參與并調(diào)控OIR大鼠視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)病變的發(fā)生。
[Abstract]:Objective:
To investigate the changes in the expression of vascular endothelial growth factor 164 (Vascular endothelial growth factorl64 (VEGF164) and Semaphorin 3A, SEMA3A) in the retina of rats with oxygen induced retinopathy (Oxygen induced retinopathy, OIR), and to explore the role and relationship of the two in the retina.
Method錛，

本文編號(hào)：1973620