發(fā)布時(shí)間：2018-04-17 06:01

  本文選題：喉鱗狀細(xì)胞癌 + 實(shí)時(shí)熒光定量PCR��； 參考：《中國醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 前言 目前研究表明,惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程,涉及多種基因的功能異常。引起基因表達(dá)異常的機(jī)制有兩種：一為遺傳學(xué)機(jī)制即DNA結(jié)構(gòu)改變。二為表遺傳學(xué)機(jī)制。表遺傳學(xué)是研究非DNA序列變化引起的,可遺傳的基因表達(dá)的改變。腫瘤發(fā)生中的主要表遺傳學(xué)改變是腫瘤抑制基因發(fā)生DNA高甲基化和染色質(zhì)中的組蛋白修飾。近幾年來,表遺傳學(xué)改變的研究取得了長足進(jìn)展,也成為喉癌臨床基礎(chǔ)研究的前沿。 現(xiàn)在普遍認(rèn)為DNA甲基化是除缺失與突變之外導(dǎo)致基因失活的第三種機(jī)制,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。腫瘤甚至可以被認(rèn)為是由DNA的突變和表觀遺傳學(xué)的改變共同導(dǎo)致的,而且表觀遺傳學(xué)的變化在腫瘤發(fā)生中早于DNA的突變。組蛋白的甲基化作為另一種表遺傳學(xué)機(jī)制,可以改變?nèi)旧w的狀態(tài),進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。H3-K9甲基化可以抑制基因表達(dá)；而H3-K4甲基化則具有激活效應(yīng)。H3-K9的甲基化與DNA的甲基化在基因的沉默機(jī)制中具有協(xié)同作用,而H3-K4的甲基化拮抗DNA甲基化所產(chǎn)生的基因沉默,研究表明在DNA甲基化及組蛋白甲基化之間存在著相互關(guān)系,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。 喉癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在我國北方地區(qū)位于頭頸部惡性腫瘤的第一位,在我國南方地區(qū),僅次于鼻咽癌居于第二位；在世界范圍內(nèi),居于全身惡性腫瘤的第十一位。其發(fā)病率有逐年上升的趨勢,大約占新發(fā)惡性腫瘤的1%左右。近30年雖然外科技術(shù),放化療手段不同程度的得到提高,但是目前喉癌仍是僅有的兩個(gè)五年生存率未增長的腫瘤之一。原因之一就是目前喉癌發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制仍不清楚,早期診斷及治療不理想。因此深入研究喉癌的發(fā)病機(jī)制,尋找早期診斷及早期治療的新靶點(diǎn)非常重要。有研究表明檢測特定基因甲基化狀態(tài)有望為腫瘤的早期診斷提供幫助,但目前在喉癌中的研究剛剛起步,比較理想的靶基因非常少。另外一個(gè)原因可能是喉癌的治療方面不理想,目前在我國喉癌的治療主要是手術(shù)治療和放射治療,手術(shù)給患者帶來很大的痛苦,遠(yuǎn)期療效尤其是晚期患者不盡人意,從長遠(yuǎn)看,化療聯(lián)合治療方案更能夠保全器官和功能,化療效果值得深入研究,目前去甲基化治療已經(jīng)成為全世界腫瘤研究的熱點(diǎn),為攻克腫瘤這一頑疾提供新的思路。 CHFR基因是一個(gè)新的有絲分裂前期檢查點(diǎn)基因。在正常組織中廣泛表達(dá),位于紡錘體組裝稽查點(diǎn)的上游。當(dāng)存在有絲分裂應(yīng)激時(shí),CHFR通路激活,通過泛素化降解Plkl(Polo-like kinase 1),Plkl調(diào)控Cdc25和’Weel激酶的磷酸化,在G2期進(jìn)入M期時(shí)控制Cdc2激酶的活性,而延遲染色體凝集,使細(xì)胞周期停滯于有絲分裂早期,紡錘體不能形成,直至錯(cuò)誤被糾正。CHFR基因如發(fā)生改變不能阻斷異常細(xì)胞通過G2期進(jìn)入有絲分裂中前期,從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。已有研究發(fā)現(xiàn),MAD,BUB等有絲分裂檢查基因在多數(shù)腫瘤中很少失活,而CHFR在胃癌,肺癌,食道癌等惡性腫瘤中因啟動(dòng)子區(qū)甲基化表現(xiàn)為失活或低表達(dá),與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切,因其具有腫瘤特異性,受到越來越多的人關(guān)注,而與喉癌發(fā)生的關(guān)系及DNA甲基化和組蛋白甲基化對(duì)其的調(diào)控目前國內(nèi)外未見報(bào)道。 目的 通過探討喉癌組織及Hep-2人喉癌細(xì)胞系中CHFR基因表達(dá),啟動(dòng)子區(qū)甲基化以及組蛋白H3-K4,H3-K9甲基化,以及5-Aza-dC及TSA對(duì)基因表達(dá)和甲基化水平的影響,從而明確其與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,探討喉癌的發(fā)生分子學(xué)機(jī)制及其早期診斷及治療靶點(diǎn)。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象 Hep-2人喉癌細(xì)胞系、50例喉癌患者腫瘤及15例正常粘膜。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2人喉癌細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)液,NaHCO2濃度2g／L,青霉素G濃度100U／L,鏈霉素濃度100μg／L,37℃含5%CO2的濕潤空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 2、實(shí)驗(yàn)分組 (1)Hep-2人喉癌細(xì)胞 對(duì)照組：同期培養(yǎng)不加藥的Hep-2人喉癌細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)組：①5-Aza-dC組：加5umol/L 5-Aza-dC培養(yǎng)72小時(shí)；②TSA組：加TSA 300 nmol培養(yǎng)24小時(shí)；③5-Aza-dC及TSA組：加5umol/L 5-Aza-dC培養(yǎng)48小時(shí)后加TSA 300nmol繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。 (2)喉癌組織標(biāo)本 臨床病例的收集：選擇2008年1月-2009年1月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科住院的喉鱗狀細(xì)胞癌患者50例(喉癌組),男44例,女6例,年齡40-74歲,平均58±9.76歲。選取其中的15例喉全切除術(shù)標(biāo)本中,距離腫瘤邊緣2.0cm的粘膜組織作為對(duì)照組。按照2002年UICC喉癌分期標(biāo)準(zhǔn)將本研究的喉癌標(biāo)本進(jìn)行分期：早期(Ⅰ期+Ⅱ期)22例(T1N0 5例T2N0 17例),聲門上型12例,聲門型10例。中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)28例(T2N1 1例,T2N2 1例,T3N0 9例,T3N18例,T3N2 4例,T4N0 7例),聲門上型16例,聲門型12例,所有喉癌組織均經(jīng)病理證實(shí)為鱗癌。術(shù)前均未經(jīng)放、化療治療。 3、引物設(shè)計(jì) MSP、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、CHIP引物序列和反應(yīng)條件見表1-3,引物由TaKaRa公合成。 4、甲基化特異性PCR (MSP)法檢測DNA甲基化水平 分別提取喉癌細(xì)胞系,喉癌組織中DNA。紫外分光光度儀定性、定量。亞硫酸氫鈉修飾DNA, Wizard DNA Clean-up Systerm(Promega)純化。離心沉淀DNA。采用甲基化特異性PCR方法。PCR反應(yīng)條件：95℃12min后,95℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,45個(gè)循環(huán),72℃再延伸7min,瓊脂糖凝膠電泳,EB染色。結(jié)果經(jīng)Alpha Image 2000自動(dòng)成像儀成像采集數(shù)據(jù),分析電泳結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Realtime fluro-genetic quantitative PCR)法檢測mRNA水平 用TRIzol試劑一步法分別提取喉癌細(xì)胞系,喉癌組織總RNA(按說明書進(jìn)行)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。無RNA酶的雙蒸水將cDNA10倍稀釋。進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔct方法進(jìn)行相對(duì)定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 6、染色質(zhì)免疫沉淀分析(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)檢測組蛋白H3K9,H3K4甲基化水平 收集細(xì)胞,甲醛交聯(lián)組蛋白和DNA。酶切后分別加H3-K9,H3-K4甲基化抗體,免疫血清或Tris-EDTA緩沖液。收集抗體／蛋白復(fù)合物,沉淀下來的染色質(zhì)通過PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果。結(jié)果經(jīng)Alpha Image 2000自動(dòng)成像儀成像采集數(shù)據(jù),分析電泳結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 7、Western Blot法檢測CHFR蛋白、H3總蛋白、H3K9甲基化蛋白、H3K4甲基化蛋白水平 提取蛋白,電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)膜,BSA封閉。分別加入CHFR, H3, H3K4甲基化、H3K9甲基化、actin兔單克隆抗體,然后加入單克隆二抗,成像,采集數(shù)據(jù)。采用條帶密度值與相應(yīng)actin密度值的比值作為指標(biāo)進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值進(jìn)行分析。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件分析,mRNA表達(dá)水平定量測定結(jié)果用t檢驗(yàn),啟動(dòng)子甲基化結(jié)果用χ2檢驗(yàn)(Fisher,精確概率法),mRNA的表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用t檢驗(yàn),甲基化和臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。Western印跡的蛋白結(jié)果應(yīng)用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì),P0.05,認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、喉癌組織中CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況 在喉癌組織中,正常對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化,在喉癌組中CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為22%(11／50),兩者相比,差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。其中T1+T2期10例,T3期1例,T4期未發(fā)現(xiàn)甲基化,T1+T2期甲基化率(41.6%1／24)明顯高于T3+T4期(3.8%1／26),甲基化程度在臨床T分期方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.01(x2=7.50)。而在年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、病理分化和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2、喉癌組織中CHFR基因mRNA表達(dá) CHFR基因在對(duì)照組mRNA全部表達(dá)。在喉癌組mRNA有2例表達(dá)缺失(4%),48例表達(dá)量明顯下調(diào),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。50例喉癌組織中,T1+T2期CHFR基因mRNA相對(duì)表達(dá)量0.29±0.18,T3+T4期相對(duì)表達(dá)量0.69±0.15,前者明顯低于后者,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),在不同的性別、年齡、腫瘤位置、分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面CHFR基因mRNA水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。甲基化組CHFR基因mRNA表達(dá)量為0.16±0.13,非甲基化組mRNA表達(dá)量為0.65±0.17,前者明顯低于后者,二者有密切關(guān)系。(P0.05)。 3、在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中5-Aza-dC和TSA處理前后CHFR基因CHFR啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況 在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中,CHFR啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)為高甲基化,5-Aza-dC作用后DNA甲基化程度減弱,出現(xiàn)半甲基化,TSA作用后DNA甲基化程度無明顯變化。聯(lián)合使用5-Aza-dC+TSA后DNA甲基化程度明顯減弱。 4、在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中5-Aza-dC和TSA處理前后CHFR基因mRNA表達(dá)情況 同對(duì)照組比較,用5-Aza-dC作用后CHFR基因mRNA表達(dá)量上調(diào)(1.75±0.21)。用TSA作用后mRNA表達(dá)量(1.05±0.13)無明顯變化。聯(lián)合使用5-Aza-dC+TSA后mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(2.15±0.18) 5、在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3-K4甲基化,組蛋白H3-K9甲基化情況及與DNA甲基化的關(guān)系 在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中,CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9甲基化與DNA甲基化正相關(guān),而組蛋白H3K4甲基化與DNA的甲基化負(fù)相關(guān)。基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9甲基化與DNA的甲基化在基因的表達(dá)下調(diào)機(jī)制中具有協(xié)同作用,而組蛋白H3K4甲基化拮抗DNA甲基化所產(chǎn)生的基因表達(dá)下調(diào)。 6、在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中,5-Aza-dC和TSA處理前后的CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K9甲基化、H3K4甲基化狀態(tài)分析 (1) 5-Aza-dC對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域H3K9甲基化有明顯作用,5-Aza-dC明顯降低啟動(dòng)子區(qū)H3K9甲基化程度,TSA對(duì)啟動(dòng)子區(qū)甲基化無影響,聯(lián)合給予5-Aza-dC和TSA與單獨(dú)給予5-Aza-dC的作用相似。 (2)5-Aza-dC對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域H3K4甲基化的作用與對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域H3K9甲基化的作用恰好相反,5-Aza-dC明顯提高啟動(dòng)子區(qū)H3K4甲基化程度,TSA對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域H3K4甲基化無影響,聯(lián)合給予5-Aza-dC和TSA與單獨(dú)給予5-Aza-dC的作用相似。 7、Western Blot法分析喉癌組織中CHFR蛋白表達(dá) 喉癌組46.0%(23／50)的喉鱗狀細(xì)胞癌未檢測到CHFR蛋白表達(dá)；所有黏膜均有CHFR蛋白表達(dá)。β-actin蛋白在喉鱗癌和正常黏膜中表達(dá)水平相似。CHFR蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.85；P0.001) 8、Western Blot法分析5-Aza-dC和TSA處理前后Hep-2人喉癌細(xì)胞系中CHFR蛋白,H3蛋白,甲基化組蛋白H3-K9,甲基化組蛋白H3-K4表達(dá) 5-Aza-dC作用后,CHFR蛋白表達(dá)量能明顯增加,TSA對(duì)CHFR蛋白表達(dá)無明顯影響,聯(lián)合給予5-Aza-dC和TSA與單獨(dú)給予5-Aza-dC的作用相似。5-Aza-dC及TSA作用后甲基化H3K9蛋白,甲基化H3K4蛋白,總H3蛋白無明顯變化。 結(jié)論 1、在喉癌組織中抑癌基因CHFR啟動(dòng)子區(qū)CpG島過甲基化與mRNA和蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)有關(guān),可能與喉癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),與臨床T分期的關(guān)系可能更為密切,檢測其甲基化狀態(tài)可有助于喉癌早期診斷。 2、在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)抑癌基因CHFR啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),同時(shí)mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),為臨床治療喉癌提供新思路。 3、在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中抑癌基因CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9甲基化與DNA甲基化在其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中呈正相關(guān),而組蛋白H3K4甲基化與DNA的甲基化呈負(fù)相關(guān)。DNA甲基化與組蛋白H3-K9甲基化在其基因表達(dá)缺失或下調(diào)中起協(xié)調(diào)作用,而DNA甲基化與組蛋白H3-K4甲基化起拮抗作用。 4、在Hep-2人喉癌細(xì)胞系中甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能明顯影響抑癌基因CHFR啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9甲基化和H3K4甲基化程度,而組蛋白脫乙�；种苿⿲�(duì)啟動(dòng)子區(qū)甲基化無明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 殷德濤,董明敏;喉鱗狀細(xì)胞癌中脆性組氨酸三聯(lián)體基因啟動(dòng)子甲基化及其蛋白的表達(dá)[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2005年06期

2 吳昊;欒信庸;周維昒;潘新良;許風(fēng)雷;雷大鵬;;Fhit蛋白與喉咽癌生物學(xué)行為相關(guān)性研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2006年06期

3 張松,孔維佳,劉爭;喉癌組織中DNA修復(fù)基因O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子區(qū)過甲基化研究[J];中華耳鼻咽喉科雜志;2004年03期

4 Koga Y.;Kitajima Y.;Miyoshi A.;K.Miyazaki;宋平;;胃癌CHFR基因異常甲基化對(duì)微管抑制劑臨床療效的重要影響[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(胃腸病學(xué)分冊(cè));2006年09期

，

本文編號(hào)：1762360