本文選題：先天性小耳畸形　切入點：維甲酸　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2011年博士論文

【摘要】：目的：通過觀察維甲酸干預后耳廓軟骨細胞增殖及基因表達的情況,并比對正常耳廓軟骨細胞增殖及基因表達的情況,分析維甲酸對耳廓軟骨細胞性狀的影響及維甲酸作用的具體分子機制和主要通路,探討維甲酸導致先天性小耳畸形的發(fā)病機制,并進一步通過觀察維甲酸對大鼠胚胎發(fā)育的影響,為建立維甲酸誘導先天性小耳畸形動物模型積累經(jīng)驗。 方法： 1、取耳廓軟骨細胞體外培養(yǎng),培養(yǎng)液中分別加入不同濃度維甲酸,通過MTT法繪制軟骨細胞生長曲線,觀察維甲酸對軟骨細胞增殖的影響,利用實時熒光定量PCR技術觀察維甲酸對軟骨細胞相關標志性基因表達的影響,探討維甲酸對耳廓軟骨性狀的影響。 2、取耳廓軟骨細胞體外培養(yǎng),對照組正常培養(yǎng),實驗組加入維甲酸,培養(yǎng)48小時后取軟骨細胞RNA進行全基因組表達芯片檢測,分析維甲酸對軟骨細胞全基因組表達的影響,并通過Gene Ontology方法分析維甲酸對軟骨細胞作用的靶基因、生物學過程、分子功能、細胞成分等信息。通過Pathway方法構建基于信號通路的基因相互作用網(wǎng)絡,探討維甲酸導致先天性小耳畸形的具體機制,為進一步研究維甲酸導致先天性畸形的分子基礎提供依據(jù)。。3、通過腹腔注射法在孕13.5天對Wistar孕大鼠應用維甲酸干預,于孕20天剖腹取大鼠胚胎,觀察維甲酸對大鼠胚胎發(fā)育的影響,為建立維甲酸誘導先天性小耳畸形大鼠模型摸索經(jīng)驗。 結果 1、維甲酸干預可降低耳廓軟骨細胞的增殖速度,并且具有時間和劑量依賴性,與正常耳廓軟骨細胞相對照,0.5*10-6mol/L濃度維甲酸在第七天,1*10-6mol/L濃度維甲酸在第二天即可降低軟骨細胞的增殖速度,研究組與對照組間存在統(tǒng)計學差異。 2.1*10-6mol/L濃度維甲酸干預耳廓軟骨細胞48小時后,實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)軟骨細胞標志物Col2A1的表達降低了53%,Col10A1降低了43%,與軟骨細胞性狀相關的基因ALP的表達降低了43%,Runx2降低了29%。運用Prizm 4統(tǒng)計分析軟件進行T-test分析,Col10A1和ALP在處理組的表達相對于對照組具有非常顯著的統(tǒng)計學意義(P0.0001).Co12A1和Runx2的表達在處理中也有降低的趨勢,但沒有統(tǒng)計學意義。 3、相對正常對照,1*10-6mol/L濃度維甲酸干預耳廓軟骨細胞48小時導致多個基因表達改變,差異基因功能集中于細胞增殖、分化、凋亡、遷移及細胞周期等多方面,通過統(tǒng)計及基因功能分析,篩選出多個候選基因：Cyp26A1、Cyp26B1、RARRES3、RARRES1、NANOS1、SNAI2、MGP、DAPK-1、SOX4、PLK2、CCNA2、ATP5H等。GO分析和Pathway分析顯示維甲酸通過多種通路及途徑對耳廓軟骨細胞施加影響。對比相關文獻發(fā)現(xiàn)維甲酸作用具有組織特異性。 4、維甲酸干預可對大鼠胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響,包括發(fā)育停滯、死亡及多種先天性畸形,其中存在外耳發(fā)育異常。相比胃管灌注法,腹腔注射法所用劑量應適當調(diào)整。 結論： 1、維甲酸可抑制耳廓軟骨細胞的增殖,其作用具有時間和劑量依賴性,并對軟骨細胞性狀造成一定的不良影響。 2、維甲酸對耳廓軟骨細胞基因表達的影響顯示,維甲酸導致先天性小耳畸形的作用機制一是通過干擾多種途徑和通路干預外耳發(fā)育,二是通過干擾與發(fā)育相關的多種基因的表達調(diào)控進而影響外耳軟骨的發(fā)育。 3、維甲酸干預可對大鼠胚胎發(fā)育造成多種不良影響,其中包括外耳發(fā)育異常,但建立穩(wěn)定的先天性小耳畸形大鼠模型所需的維甲酸干預的途徑、劑量及時機均有待進一步研究。
[Abstract]:Objective: through the proliferation and gene expression of cartilage cell by retinoic acid after intervention, and compared the expression of proliferation of normal cartilage cell and gene analysis, the molecular mechanism of retinoic acid effects on cartilage cell traits and retinoic acid and retinoic acid on main pathway, resulting in congenital microtia malformation pathogenesis, and further through the effect of retinoic acid on rat embryonic development, for the establishment of retinoic acid induced congenital microtia animal model of the accumulation of experience.
Method錛，

本文編號：1662491