本文選題：線粒體　切入點：遺傳性　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一章：母系遺傳線粒體性耳聾1555AG突變大家系臨床分子研究 線粒體DNA或編碼線粒體蛋白的核基因發(fā)生改變,導(dǎo)致氧化磷酸化異常,細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠的ATP而導(dǎo)致細(xì)胞功能減退甚至壞死,即線粒體病。臨床表型的異質(zhì)性是線粒體疾病的典型特征,而表型的異質(zhì)性一直原因不清。線粒體1555AG突變是引起藥物性耳聾和非綜合性耳聾最常見的原因,攜帶此突變的家系呈現(xiàn)多變的臨床表型和不完全的外顯率,具體機(jī)制是不清楚和復(fù)雜的。我們對一個6代100余人的中國大家系進(jìn)行了臨床、分子、閾值、核基因GJB2、TRMU以及線粒體單體型的分析,以期了解線粒體單體型、環(huán)境因素、核基因背景、線粒體1555AG突變拷貝數(shù)在此攜帶線粒體1555AG突變家系中的作用。在臨床聽力評估中我們嘗試用高頻測聽方法,發(fā)現(xiàn)沒有接觸氨基糖甙類藥物的家系成員聽力圖呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,聽力損失最早出現(xiàn)在12kHZ,繼之聽力損傷從超高頻12kHz延伸到高頻8kHz、4kHz。我們用焦磷酸測序檢測到同質(zhì)1555AG變變和1555AG異質(zhì)突變,除一人攜帶異質(zhì)性1555AG突變外其余均為同質(zhì)性1555AG突變,1555AG變變的閾值和耳聾臨床表型無關(guān)。在核修飾基因GJB2檢測中,攜帶1555AG突變的母系成員中7人檢測到雜合的T123N,其中攜帶T123N和1555AG的母系成員中使用氨基糖甙類藥物者比未使用氨基糖甙類藥物者聽力損失嚴(yán)重,未使用氨基糖甙類藥物者且同時攜帶T123N和1555AG的個體比只攜帶1555AG的個體聽力損失更為嚴(yán)重。核基因TRMU第一外顯子的檢測未見有意義突變A10S。此家系所有母系成員進(jìn)化樹分析為線粒體單體型B4C1C,有趣的是和一個以前已報道的中國家系同屬于單體型B4C1C,當(dāng)氨基糖甙類藥物作用計算在內(nèi)時,兩家系的外顯率分別是63.6%和5.9%,去除氨基糖甙類藥物作用的影響,外顯率分別是51.5%和0%。雖然兩個中國家系分享同樣的單體型并且同樣缺乏可能提高外顯率的功能性二級突變,卻呈現(xiàn)出完全不同的外顯率。試驗結(jié)果提示該家系耳聾的高外顯率和單體型B4C1C、1555AG變變閾值關(guān)系并不密切,因此我們推測此家系較高的外顯率起主要作用的是環(huán)境和/或核修飾基因。氨基糖甙類藥物和其他未知的核基因可能是決定性因素。 第二章：核基因TFB1M、TRMU對耳蝸線粒體及毛細(xì)胞的作用機(jī)制 研究背景：母系遺傳線粒體耳聾是遺傳性耳聾的一種,但是精確的線粒體缺失導(dǎo)致組織特異性的耳聾的病理機(jī)制目前不清。最常見的線粒體耳聾是A1555G突變,臨床異質(zhì)性一直是研究A1555G突變的難點。核基因可能是線粒體耳聾A1555G突變的臨床表型的修飾因子。尋找線粒體A1555G突變的核修飾基因最理想的方法就是研究具有相同A1555G突變但臨床表型不同的家系成員的耳蝸細(xì)胞表達(dá)差異。因為無法獲取耳蝸組織,所以采用早期的家系連鎖分析方法,定位了TRMU、MT01、TFB1M、GTPBp3這四個核基因和線粒體RNA修飾有關(guān)。而mtTFBIM和線粒體耳聾綜合癥的潛在的關(guān)系被注意是因為在KsgA缺乏的大腸桿菌株表達(dá)h-mtTFBl后可以恢復(fù)16S莖環(huán)的甲基化和對氨基糖甙類藥物(春雷霉素)的敏感性。TFBM、TFAM、mtRNA聚合酶是哺乳動物線粒體轉(zhuǎn)錄機(jī)制核心組成部分,在線粒體生物合成中起著至關(guān)重要的作用。TFBM由核基因編碼轉(zhuǎn)運至線粒體。有研究發(fā)現(xiàn)A1555G突變同TFB1M過表達(dá)相似,可以導(dǎo)致12S rRNA超甲基化,導(dǎo)致相同的有缺陷的逆向線粒體合成信號,誘導(dǎo)對壓力改變易凋亡的易感細(xì)胞。而線粒體12S rRNA的甲基化是維持哺乳動物核糖體必需的,12S rRNA甲基化有可能是以前未認(rèn)識到的線粒體合成的異常信號。鑒于沒有一個真正意義的具有類似A1555G線粒體DNA突變的老鼠模型,因此設(shè)想觀察新霉素誘導(dǎo)下小鼠核基因TFB1、TRMU、耳蝸線粒體、毛細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系。即外源化合物作用于耳蝸毛細(xì)胞,細(xì)胞核、線粒體基因是否會發(fā)生交互作用,導(dǎo)致耳聾/毛細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展。 研究目的：線粒體核修飾基因TFB1M、TRMU與正常耳蝸毛細(xì)胞和新霉素致?lián)p的耳蝸毛細(xì)胞和線粒體的作用機(jī)制。 研究方法：1、采用新生1-2天小鼠聽覺上皮體外無血清培養(yǎng)模型,建立新霉素致?lián)p模型。2、活細(xì)胞動態(tài)檢測線粒體膜電位的變化,了解線粒體的功能。3、檢測基因TFB1M、TRMU在聽覺上皮細(xì)胞核和線粒體中的表達(dá)以及部分凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)果：在新霉素致?lián)p4小時后,盡管基底膜中圈外毛細(xì)胞形態(tài)完整,但是已經(jīng)出現(xiàn)線粒體膜電位的改變；新霉素致?lián)p4小時洗脫后3小時,線粒體底圈、中圈膜電位消失,在底圈、中圈出現(xiàn)散在死亡的毛細(xì)胞,底圈較中圈多,頂圈未見死亡細(xì)胞。新霉素致?lián)p12小時線粒體底圈、中圈大量毛細(xì)胞缺失,并導(dǎo)致膜電位明顯降低；24小時線粒體膜電位完全消失,caspase9、caspase8表達(dá)高。新霉素致?lián)p12小時,耳蝸聽覺上皮細(xì)胞線粒體以及核內(nèi)的TFB1M表達(dá)上調(diào),在此時間點同時出現(xiàn)線粒體膜電位的改變、外毛細(xì)胞大量消失。新霉素致?lián)p24小時洗脫后48小時出現(xiàn)caspase7、caspase9、caspase8高表達(dá),caspase3、XIAP低表達(dá)。聽覺上皮細(xì)胞核內(nèi)TFB1M蛋白的表達(dá)稍低,TRMU的表達(dá)在兩組無明顯差異。 結(jié)論： 1、新霉素致?lián)p小鼠基底膜洗脫期的凋亡途徑可能存在線粒體之外的其他途徑。 2、在新霉素致?lián)p洗脫期,RNA修飾基因TRMU和RNA甲基轉(zhuǎn)移酶TFB1M表達(dá)無明顯改變。 3、在新霉素致?lián)p12小時,細(xì)胞核內(nèi)基因TFB1M蛋白質(zhì)水平的表達(dá)上調(diào),并且和線粒體膜電位消失、外毛細(xì)胞大量丟失共存。TFB1M蛋白質(zhì)水平的表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致12S rRNA超甲基化,繼而影響毛細(xì)胞凋亡和線粒體功能喪失。TFB1M蛋白質(zhì)水平的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的12S rRNA超甲基化可能對毛細(xì)胞的線粒體合成起副效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R764

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;世界人類基因組與人權(quán)宣言——聯(lián)合國教育、科學(xué)及文化組織[J];中國醫(yī)學(xué)倫理學(xué);1998年02期

2 ;Mitochondrial tRNA~(Glu) A14693G variant may modulate the phenotypic manifestation of deafness-associated 12S rRNA A1555G mutation in a Han Chinese family[J];遺傳學(xué)報;2009年04期

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本文編號：1612251