本文關(guān)鍵詞： MD-2 人角膜上皮細(xì)胞 LPS TLR4 綠膿桿菌性角膜炎　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 細(xì)菌性角膜炎(bacterial keratitis)是指由細(xì)菌感染引起的角膜化膿性炎癥,至今仍是世界性的常見致盲眼病。在許多國(guó)家和地區(qū),銅綠假單胞菌是首位的細(xì)菌性角膜炎致病菌,銅綠假單胞菌屬于革蘭氏陰性的條件致病菌,該菌可以產(chǎn)生多種致病因子,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是其最主要的致病因子,LPS通過誘導(dǎo)角膜細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等,發(fā)揮關(guān)鍵的致炎作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)LPS刺激產(chǎn)生應(yīng)答,需要通過一系列蛋白輔助,其中產(chǎn)生應(yīng)答的起始為L(zhǎng)PS受體復(fù)合物。目前認(rèn)為L(zhǎng)PS受體復(fù)合物至少包括四個(gè)組成部分：LPS結(jié)合蛋白(LPS binding protein, LBP)、CD14、髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation-2, MD-2)以及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4). MD-2分子的發(fā)現(xiàn)是近些年來LPS受體復(fù)合物研究方面最重要的進(jìn)展之一,MD-2關(guān)聯(lián)LPS與TLR4,為L(zhǎng)PS/TLR4信號(hào)途徑提供必需的橋接。然而,人角膜上皮細(xì)胞對(duì)LPS刺激是否發(fā)生應(yīng)答,可能與人角膜上皮細(xì)胞MD-2的表達(dá)與否,以及TLR4的分布位置有關(guān)。 研究目的：本課題以人角膜上皮細(xì)胞SDHCEC1(spontaneously derived human corneal epithelial cell linel, SDHCEC1)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,體外探討人角膜上皮細(xì)胞對(duì)LPS的刺激應(yīng)答機(jī)制。 研究方法：傳代培養(yǎng)來源于中山大學(xué)眼科中心王智崇教授團(tuán)隊(duì)連續(xù)培養(yǎng)成功的人角膜上皮細(xì)胞SDHCEC1,通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免疫組化法鑒定角膜上皮細(xì)胞的特異蛋白CK3/CK12的表達(dá)。不同濃度的LPS刺激SDHCEC1細(xì)胞不同時(shí)間后,Real-time PCR檢測(cè)TLR4、CD14、IL-8和MD-2 mRNA; ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基IL-8; Western Blot檢測(cè)IκB-α和p-IκB-α的活化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SDHCEC1細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)TLR4、CD14的表達(dá)。構(gòu)建MD-2克隆質(zhì)粒并鑒定,構(gòu)建重組MD-2表達(dá)質(zhì)粒并鑒定。重組MD-2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)重組MD-2表達(dá)。將293T細(xì)胞分泌的重組MD-2蛋白加入SDHCEC1細(xì)胞培養(yǎng)基中,Real-time PCR檢測(cè)TLR4、CD14和IL-8；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4、CD14; ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基IL-8; Western Blot檢測(cè)IκB-α和p-IκB-α。 結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下,SDHCEC1細(xì)胞呈典型角膜上皮細(xì)胞形態(tài)；SDHCEC1細(xì)胞內(nèi)CK3/CK12陽(yáng)性表達(dá)。不同濃度的LPS刺激SDHCEC1細(xì)胞不同時(shí)間長(zhǎng)度后,Real-time PCR結(jié)果顯示TLR4、CD 14弱陽(yáng)性表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異,IL-8和MD-2則未見表達(dá)；ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基無IL-8的分泌；Western Blot檢測(cè)未見活化的p-IκB-α;流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)SDHCEC1細(xì)胞膜表面未見TLR4、CD 14表達(dá),而細(xì)胞質(zhì)中TLR4、CD 14弱陽(yáng)性表達(dá)。MD-2克隆質(zhì)粒和重組MD-2表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。MD-2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,Western Blot檢測(cè)重組MD-2蛋白表達(dá)。與正常細(xì)胞相比較,添加重組MD-2蛋白培養(yǎng)的SDHCEC1細(xì)胞對(duì)LPS產(chǎn)生應(yīng)答,表現(xiàn)為：Real-time PCR檢測(cè)TLR4、CD 14和IL-8 mRNA表達(dá)上調(diào)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4、CD 14在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)均陽(yáng)性表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基IL-8含量增高；Western Blot檢測(cè)到NF-κB的活化。 結(jié)論：人角膜上皮細(xì)胞SDHCEC1 MD-2表達(dá)缺失,細(xì)胞膜表面缺乏功能性的TLR4表達(dá),LPS/TLR4/MD-2信號(hào)途徑中,NF-κB不活化,細(xì)胞未見分泌促炎細(xì)胞因子IL-8,這可能是在正常情況下,人角膜上皮細(xì)胞通過調(diào)控MD-2與細(xì)胞膜表面的TLR4表達(dá),抑制對(duì)LPS刺激的先天免疫反應(yīng),避免炎癥細(xì)胞在角膜中聚集和角膜結(jié)構(gòu)被炎癥破壞,維持角膜局部的免疫自穩(wěn)狀態(tài)。但當(dāng)出現(xiàn)外源性或內(nèi)源性MD-2的時(shí)候,角膜上皮細(xì)胞可能在MD-2的誘導(dǎo)下,TLR4重新分布在細(xì)胞膜表面,并且募集下游分子,NF-κB活化,分泌促炎細(xì)胞因子,激活LPS/TLR4信號(hào)途徑,參與炎癥的發(fā)生。
[Abstract]:緇嗚弻鎬ц鑶滅値(bacterial keratitis)鏄寚鐢辯粏鑿屾劅鏌撳紩璧風(fēng)殑瑙掕啘鍖栬創(chuàng)鎬х値鐥，

本文編號(hào)：1516845