發(fā)布時間：2018-02-17 00:58

  本文關(guān)鍵詞： MD-2 人角膜上皮細胞 LPS TLR4 綠膿桿菌性角膜炎　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 細菌性角膜炎(bacterial keratitis)是指由細菌感染引起的角膜化膿性炎癥,至今仍是世界性的常見致盲眼病。在許多國家和地區(qū),銅綠假單胞菌是首位的細菌性角膜炎致病菌,銅綠假單胞菌屬于革蘭氏陰性的條件致病菌,該菌可以產(chǎn)生多種致病因子,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是其最主要的致病因子,LPS通過誘導(dǎo)角膜細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等,發(fā)揮關(guān)鍵的致炎作用。哺乳動物細胞對LPS刺激產(chǎn)生應(yīng)答,需要通過一系列蛋白輔助,其中產(chǎn)生應(yīng)答的起始為LPS受體復(fù)合物。目前認為LPS受體復(fù)合物至少包括四個組成部分：LPS結(jié)合蛋白(LPS binding protein, LBP)、CD14、髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation-2, MD-2)以及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4). MD-2分子的發(fā)現(xiàn)是近些年來LPS受體復(fù)合物研究方面最重要的進展之一,MD-2關(guān)聯(lián)LPS與TLR4,為LPS/TLR4信號途徑提供必需的橋接。然而,人角膜上皮細胞對LPS刺激是否發(fā)生應(yīng)答,可能與人角膜上皮細胞MD-2的表達與否,以及TLR4的分布位置有關(guān)。 研究目的：本課題以人角膜上皮細胞SDHCEC1(spontaneously derived human corneal epithelial cell linel, SDHCEC1)作為實驗對象,體外探討人角膜上皮細胞對LPS的刺激應(yīng)答機制。 研究方法：傳代培養(yǎng)來源于中山大學(xué)眼科中心王智崇教授團隊連續(xù)培養(yǎng)成功的人角膜上皮細胞SDHCEC1,通過光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài),免疫組化法鑒定角膜上皮細胞的特異蛋白CK3/CK12的表達。不同濃度的LPS刺激SDHCEC1細胞不同時間后,Real-time PCR檢測TLR4、CD14、IL-8和MD-2 mRNA; ELISA檢測細胞培養(yǎng)基IL-8; Western Blot檢測IκB-α和p-IκB-α的活化；流式細胞術(shù)檢測SDHCEC1細胞膜表面和細胞內(nèi)TLR4、CD14的表達。構(gòu)建MD-2克隆質(zhì)粒并鑒定,構(gòu)建重組MD-2表達質(zhì)粒并鑒定。重組MD-2表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,Western Blot檢測重組MD-2表達。將293T細胞分泌的重組MD-2蛋白加入SDHCEC1細胞培養(yǎng)基中,Real-time PCR檢測TLR4、CD14和IL-8；流式細胞術(shù)檢測TLR4、CD14; ELISA檢測細胞培養(yǎng)基IL-8; Western Blot檢測IκB-α和p-IκB-α。 結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下,SDHCEC1細胞呈典型角膜上皮細胞形態(tài)；SDHCEC1細胞內(nèi)CK3/CK12陽性表達。不同濃度的LPS刺激SDHCEC1細胞不同時間長度后,Real-time PCR結(jié)果顯示TLR4、CD 14弱陽性表達,統(tǒng)計學(xué)無顯著差異,IL-8和MD-2則未見表達；ELISA檢測培養(yǎng)基無IL-8的分泌；Western Blot檢測未見活化的p-IκB-α;流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)SDHCEC1細胞膜表面未見TLR4、CD 14表達,而細胞質(zhì)中TLR4、CD 14弱陽性表達。MD-2克隆質(zhì)粒和重組MD-2表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。MD-2表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后,Western Blot檢測重組MD-2蛋白表達。與正常細胞相比較,添加重組MD-2蛋白培養(yǎng)的SDHCEC1細胞對LPS產(chǎn)生應(yīng)答,表現(xiàn)為：Real-time PCR檢測TLR4、CD 14和IL-8 mRNA表達上調(diào)；流式細胞術(shù)檢測TLR4、CD 14在細胞表面和細胞內(nèi)均陽性表達；ELISA檢測細胞培養(yǎng)基IL-8含量增高；Western Blot檢測到NF-κB的活化。 結(jié)論：人角膜上皮細胞SDHCEC1 MD-2表達缺失,細胞膜表面缺乏功能性的TLR4表達,LPS/TLR4/MD-2信號途徑中,NF-κB不活化,細胞未見分泌促炎細胞因子IL-8,這可能是在正常情況下,人角膜上皮細胞通過調(diào)控MD-2與細胞膜表面的TLR4表達,抑制對LPS刺激的先天免疫反應(yīng),避免炎癥細胞在角膜中聚集和角膜結(jié)構(gòu)被炎癥破壞,維持角膜局部的免疫自穩(wěn)狀態(tài)。但當(dāng)出現(xiàn)外源性或內(nèi)源性MD-2的時候,角膜上皮細胞可能在MD-2的誘導(dǎo)下,TLR4重新分布在細胞膜表面,并且募集下游分子,NF-κB活化,分泌促炎細胞因子,激活LPS/TLR4信號途徑,參與炎癥的發(fā)生。
[Abstract]:緇嗚弻鎬ц鑶滅値(bacterial keratitis)鏄寚鐢辯粏鑿屾劅鏌撳紩璧風(fēng)殑瑙掕啘鍖栬創(chuàng)鎬х値鐥，

本文編號：1516845