本文關(guān)鍵詞：去細(xì)胞犬喉支架的體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)

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【摘要】：喉移植被認(rèn)為是喉功能重建的理想方法，目前臨床上已經(jīng)有兩例喉移植成功的報道[1,2]，但是患者不得不長期應(yīng)用免疫抑制劑，這必然增加了腫瘤復(fù)發(fā)、機(jī)會性感染和代謝性疾病的幾率。應(yīng)用去細(xì)胞技術(shù)制作低免疫原性的生物材料，已經(jīng)在部分組織修復(fù)中得到應(yīng)用[3-5]。早期的去細(xì)胞生物材料局限于皮膚、膀胱壁、小腸、心包等薄層組織或器官[6]。2008年Ott[7]等利用冠脈灌注法首次制作了小鼠心臟的去細(xì)胞生物支架，開啟了整體器官去細(xì)胞生物支架的新時代。我科利用Ott[7]報道的方法成功灌注出了兔、犬喉支架，并完成了免疫學(xué)、力學(xué)等測試，證實(shí)了去細(xì)胞喉支架沒有改變基質(zhì)的生物力學(xué)性質(zhì)，而且具有低免疫原性的特點(diǎn)[8-10]。但這種去細(xì)胞犬喉支架植入宿主體內(nèi)能否長期存活尚不明確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用去細(xì)胞犬喉支架植入宿主犬胸大肌內(nèi)，通過大體觀察、組織學(xué)檢查、軟骨細(xì)胞存活率等指標(biāo)明確該支架是否存活，進(jìn)一步評估去細(xì)胞犬喉支架的性能，為全喉功能重建探索新方法。 目的 1.利用灌注法制備完整的去細(xì)胞犬喉支架，明確灌注前后犬喉形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、免疫原性及軟骨細(xì)胞活性的變化。 2.通過動物體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)，明確去細(xì)胞犬喉支架能否在宿主犬胸大肌內(nèi)長期存活，為下一步喉移植提供理實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。 方法 1.制備去細(xì)胞犬喉支架及其相關(guān)檢查 實(shí)驗(yàn)組離體犬喉保留雙側(cè)環(huán)甲動脈，持續(xù)灌注十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecyl sulfate,SDS）、曲拉通X-100（TritonX-100）等去離子劑，去除喉黏膜、肌肉、韌帶內(nèi)強(qiáng)免疫原性的細(xì)胞成分，保留其無免疫原性的細(xì)胞外基質(zhì)和低免疫原性的軟骨細(xì)胞，得到低免疫原性的去細(xì)胞犬喉支架；行大體觀察、組織學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查及軟骨細(xì)胞存活率檢查。 2.體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn) 分別將去細(xì)胞犬喉支架及喉標(biāo)本植入實(shí)驗(yàn)組及對照組宿主犬右側(cè)胸大肌內(nèi)，于術(shù)后2周、1月、2月3個時間點(diǎn)處死宿主犬，取出埋植物，行大體觀察，組織學(xué)檢查及軟骨細(xì)胞存活率檢查。 結(jié)果 1.制備去細(xì)胞犬喉支架及其相關(guān)檢查 去細(xì)胞喉喉支架顏色變白，形態(tài)同正常喉，無塌陷、變形，灌注前后環(huán)狀軟骨左右徑相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HE染色可見喉支架內(nèi)上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腺體及血管均消失，軟骨膜稍離散，軟骨細(xì)胞填充于軟骨陷窩內(nèi)；灌注前后環(huán)甲肌脫氧核糖核酸(deoxyio nucleic acid，DNA)含量對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而環(huán)狀軟骨、甲狀軟骨、會厭軟骨DNA含量對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；去細(xì)胞犬喉支架環(huán)甲肌、環(huán)杓后肌、杓橫肌等去細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)無管家基因β-actin表達(dá)；灌注前后軟骨細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn) 所有宿主犬均存活至觀察終點(diǎn)。大體觀察：實(shí)驗(yàn)組埋植2周后喉支架顏色紅潤，表面有紅色膜樣物質(zhì)附著；埋植1月后紅色較前變深，表面軟組織增厚，體積較前變��；埋植2月后喉支架表面軟組織內(nèi)肉眼可見血管形成；對照組埋植2周后顏色蒼白、軟骨變薄，關(guān)節(jié)斷開，部分喉體周圍有炎性分泌物，與周圍肌肉無粘連；1月后可見小軟骨片殘存，軟骨表面有結(jié)締組織附著。環(huán)狀軟骨左右徑比較：埋置后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)環(huán)狀軟骨左右徑比較：2周組與埋置前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；1月組與2周組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），，2月組與1月組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。對照組埋植2周后與埋植前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色可見：實(shí)驗(yàn)組埋植2周后支架周圍有白細(xì)胞浸潤，而軟骨細(xì)胞及軟骨膜無明顯變化；1月后支架表面有疏松結(jié)締組織形成，高倍鏡下可見成纖維細(xì)胞和血管存在；2月后疏松結(jié)締組織增厚，成纖維細(xì)胞及血管數(shù)量增多，軟骨膜稍薄，軟骨細(xì)胞充填于軟骨陷窩內(nèi)。對照組埋植2周后標(biāo)本周圍大量淋巴細(xì)胞浸潤，軟骨膜尚完整，1月后標(biāo)本周圍大量結(jié)締組織增生，軟骨膜斷裂，淋巴細(xì)胞進(jìn)入軟骨組織，軟骨細(xì)胞大量吸收。軟骨細(xì)胞存活率變化：實(shí)驗(yàn)組埋植2周組與埋置前、1月組與2周組、2月組與1月組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。對照組2周組與埋置前、1月組與2周組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論 1.通過環(huán)甲動脈灌注去離子劑可以得到完整的去細(xì)胞犬喉支架，該支架去除了肌肉和黏膜內(nèi)強(qiáng)免疫原性的的細(xì)胞成分，保留了無免疫原性的細(xì)胞外基質(zhì)和低免疫原性的軟骨細(xì)胞；該支架的形態(tài)、大小、體積未發(fā)生明顯改變，且生物力學(xué)性能未發(fā)生明顯變化，可以作為生物工程材料進(jìn)行下一步體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)。 2.正常喉埋植2周后即誘發(fā)急性排斥反應(yīng)，喉支架逐漸被破壞、消失。 3.去細(xì)胞犬喉支架在體內(nèi)埋植后未發(fā)生嚴(yán)重免疫排斥反應(yīng)，2月后形態(tài)正常，體積稍變小，支架表面被疏松結(jié)締組織覆蓋，軟骨細(xì)胞保持較高的存活率，可以為下一步全喉移植提供支持。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R767.91

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：1250656