本文關鍵詞：去細胞犬喉支架的體內(nèi)埋植實驗

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【摘要】：喉移植被認為是喉功能重建的理想方法，目前臨床上已經(jīng)有兩例喉移植成功的報道[1,2]，但是患者不得不長期應用免疫抑制劑，這必然增加了腫瘤復發(fā)、機會性感染和代謝性疾病的幾率。應用去細胞技術制作低免疫原性的生物材料，已經(jīng)在部分組織修復中得到應用[3-5]。早期的去細胞生物材料局限于皮膚、膀胱壁、小腸、心包等薄層組織或器官[6]。2008年Ott[7]等利用冠脈灌注法首次制作了小鼠心臟的去細胞生物支架，開啟了整體器官去細胞生物支架的新時代。我科利用Ott[7]報道的方法成功灌注出了兔、犬喉支架，并完成了免疫學、力學等測試，證實了去細胞喉支架沒有改變基質(zhì)的生物力學性質(zhì)，而且具有低免疫原性的特點[8-10]。但這種去細胞犬喉支架植入宿主體內(nèi)能否長期存活尚不明確。本實驗應用去細胞犬喉支架植入宿主犬胸大肌內(nèi)，通過大體觀察、組織學檢查、軟骨細胞存活率等指標明確該支架是否存活，進一步評估去細胞犬喉支架的性能，為全喉功能重建探索新方法。 目的 1.利用灌注法制備完整的去細胞犬喉支架，明確灌注前后犬喉形態(tài)、組織結構、免疫原性及軟骨細胞活性的變化。 2.通過動物體內(nèi)埋植實驗，明確去細胞犬喉支架能否在宿主犬胸大肌內(nèi)長期存活，為下一步喉移植提供理實驗基礎和理論指導。 方法 1.制備去細胞犬喉支架及其相關檢查 實驗組離體犬喉保留雙側環(huán)甲動脈，持續(xù)灌注十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecyl sulfate,SDS）、曲拉通X-100（TritonX-100）等去離子劑，去除喉黏膜、肌肉、韌帶內(nèi)強免疫原性的細胞成分，保留其無免疫原性的細胞外基質(zhì)和低免疫原性的軟骨細胞，得到低免疫原性的去細胞犬喉支架；行大體觀察、組織學檢查、免疫學檢查及軟骨細胞存活率檢查。 2.體內(nèi)埋植實驗 分別將去細胞犬喉支架及喉標本植入實驗組及對照組宿主犬右側胸大肌內(nèi)，于術后2周、1月、2月3個時間點處死宿主犬，取出埋植物，行大體觀察，組織學檢查及軟骨細胞存活率檢查。 結果 1.制備去細胞犬喉支架及其相關檢查 去細胞喉喉支架顏色變白，形態(tài)同正常喉，無塌陷、變形，灌注前后環(huán)狀軟骨左右徑相比差異無統(tǒng)計學意義；HE染色可見喉支架內(nèi)上皮細胞、肌肉細胞、腺體及血管均消失，軟骨膜稍離散，軟骨細胞填充于軟骨陷窩內(nèi)；灌注前后環(huán)甲肌脫氧核糖核酸(deoxyio nucleic acid，DNA)含量對比差異有統(tǒng)計學意義，而環(huán)狀軟骨、甲狀軟骨、會厭軟骨DNA含量對比差異無統(tǒng)計學意義；去細胞犬喉支架環(huán)甲肌、環(huán)杓后肌、杓橫肌等去細胞基質(zhì)內(nèi)無管家基因β-actin表達；灌注前后軟骨細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義。 2.體內(nèi)埋植實驗 所有宿主犬均存活至觀察終點。大體觀察：實驗組埋植2周后喉支架顏色紅潤，表面有紅色膜樣物質(zhì)附著；埋植1月后紅色較前變深，表面軟組織增厚，體積較前變小；埋植2月后喉支架表面軟組織內(nèi)肉眼可見血管形成；對照組埋植2周后顏色蒼白、軟骨變薄，關節(jié)斷開，部分喉體周圍有炎性分泌物，與周圍肌肉無粘連；1月后可見小軟骨片殘存，軟骨表面有結締組織附著。環(huán)狀軟骨左右徑比較：埋置后各時間點實驗組與對照組對比差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）；實驗組組內(nèi)環(huán)狀軟骨左右徑比較：2周組與埋置前相比差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；1月組與2周組比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），，2月組與1月組相比差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。對照組埋植2周后與埋植前比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色可見：實驗組埋植2周后支架周圍有白細胞浸潤，而軟骨細胞及軟骨膜無明顯變化；1月后支架表面有疏松結締組織形成，高倍鏡下可見成纖維細胞和血管存在；2月后疏松結締組織增厚，成纖維細胞及血管數(shù)量增多，軟骨膜稍薄，軟骨細胞充填于軟骨陷窩內(nèi)。對照組埋植2周后標本周圍大量淋巴細胞浸潤，軟骨膜尚完整，1月后標本周圍大量結締組織增生，軟骨膜斷裂，淋巴細胞進入軟骨組織，軟骨細胞大量吸收。軟骨細胞存活率變化：實驗組埋植2周組與埋置前、1月組與2周組、2月組與1月組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。對照組2周組與埋置前、1月組與2周組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結論 1.通過環(huán)甲動脈灌注去離子劑可以得到完整的去細胞犬喉支架，該支架去除了肌肉和黏膜內(nèi)強免疫原性的的細胞成分，保留了無免疫原性的細胞外基質(zhì)和低免疫原性的軟骨細胞；該支架的形態(tài)、大小、體積未發(fā)生明顯改變，且生物力學性能未發(fā)生明顯變化，可以作為生物工程材料進行下一步體內(nèi)埋植實驗。 2.正常喉埋植2周后即誘發(fā)急性排斥反應，喉支架逐漸被破壞、消失。 3.去細胞犬喉支架在體內(nèi)埋植后未發(fā)生嚴重免疫排斥反應，2月后形態(tài)正常，體積稍變小，支架表面被疏松結締組織覆蓋，軟骨細胞保持較高的存活率，可以為下一步全喉移植提供支持。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R767.91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：1250656