本文關(guān)鍵詞：基于BAC的同源重組對抗性基因的改造及BAC-EBV感染細(xì)胞系的建立

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【摘要】：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)與多種人類腫瘤如鼻咽癌和Burrkitt淋巴瘤相關(guān)。由于EBV全基因組有172kb,不利于基因的操作。在實(shí)驗(yàn)中,為了解決這一問題,細(xì)菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)中的F因子被引入到EBV的基因組。F因子能夠讓大基因組在細(xì)菌中的復(fù)制受到嚴(yán)格控制并保持低水平拷貝(1個拷貝)�；贐AC的EBV基因組能夠隨著BAC的復(fù)制而精確復(fù)制,并能對基因進(jìn)行操作。另一方面,在體外實(shí)驗(yàn)中,由于上皮細(xì)胞缺少受體CR2, EBV不能感染上皮細(xì)胞,而且,EBV在其相關(guān)的鼻咽癌細(xì)胞系的傳代中容易丟失.因此,在體外,難以建立EBV感染的鼻咽癌上皮細(xì)胞模型。這是EBV在EBV相關(guān)性鼻咽癌的相關(guān)研究中的一個難題。 在本研究中,通過EBV早期基因BZLF1和BALF4表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞293HEK/p2089細(xì)胞(本課題組前期利用基于BAC的EBV基因組,BAC-EBV,構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系),誘導(dǎo)293HEK/p2089產(chǎn)生EB病毒顆粒,其帶有用于真核細(xì)胞篩選的潮霉素抗性基因(hyg)。這些EB病毒顆粒經(jīng)細(xì)胞與細(xì)胞接觸感染的方法,在B淋巴細(xì)胞的介導(dǎo)下,感染EBV陰性的鼻咽癌上皮細(xì)胞系。通過GFP可視化觀察與RT-PCR檢測EBV基因LMP1和LMP2的結(jié)果,表明,在本室成功建立EBV體外感染鼻咽癌上皮細(xì)胞系的方法。但是,鼻咽癌上皮細(xì)胞對潮霉素敏感性強(qiáng),難以建立穩(wěn)定的細(xì)胞系。因此,本研究設(shè)計(jì)了基于BAC的EBV基因組(BAC-EBV),將原有的潮霉素抗性基因修改為嘌呤霉素抗性基因(pac)。在載體pcDNA3.1(+)上,將兩端含有重組蛋白FLP識別位點(diǎn)(FRT)的卡那霉素抗性基因(kan)與pac基因進(jìn)行連接,兩端同時含有20bp與潮霉素抗性基因兩端同源的同源臂序列。連接后,通過常規(guī)的PCR和克隆方法,兩次延長兩端同源臂,使kan-pac兩端同源臂序列達(dá)到89bp。該同源臂延長后的線性片段通過PCR擴(kuò)增,經(jīng)電轉(zhuǎn)化、由λ噬菌體中redα(βγ系統(tǒng)介導(dǎo)在E.coli中發(fā)生同源重組(ET克隆),從而用kan-pac替代了BAC-EBV(p2089)中相應(yīng)的hyg基因。然后通過重組蛋白FLP對FRT-kan-FRT特異性的識別,切除了引入的kan基因,留下69bp的FRT“疤痕”。利用相同的方法,將前期工作中已經(jīng)在BAC-EBV基礎(chǔ)上切除EBV基因組的空白對照質(zhì)粒pM-BAC中潮霉素抗性基因修改為嘌呤霉素基因。通過抗性篩選、對菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序以及酶切的實(shí)驗(yàn)方法鑒定抗性基因修改,結(jié)果表明,成功構(gòu)建質(zhì)粒BAC-EBV/pac與pM-BAC/pac。在此基礎(chǔ)上,將BAC-EBV/pac與pM-BAC/pac,轉(zhuǎn)染至293HEK細(xì)胞,建立EBV感染的上皮細(xì)胞系及相應(yīng)的空白對照細(xì)胞系。本研究為在EBV相關(guān)的鼻咽癌研究中細(xì)胞模型的建立打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1207465