本文關鍵詞：基于BAC的同源重組對抗性基因的改造及BAC-EBV感染細胞系的建立

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【摘要】：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)與多種人類腫瘤如鼻咽癌和Burrkitt淋巴瘤相關。由于EBV全基因組有172kb,不利于基因的操作。在實驗中,為了解決這一問題,細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)中的F因子被引入到EBV的基因組。F因子能夠讓大基因組在細菌中的復制受到嚴格控制并保持低水平拷貝(1個拷貝)�；贐AC的EBV基因組能夠隨著BAC的復制而精確復制,并能對基因進行操作。另一方面,在體外實驗中,由于上皮細胞缺少受體CR2, EBV不能感染上皮細胞,而且,EBV在其相關的鼻咽癌細胞系的傳代中容易丟失.因此,在體外,難以建立EBV感染的鼻咽癌上皮細胞模型。這是EBV在EBV相關性鼻咽癌的相關研究中的一個難題。 在本研究中,通過EBV早期基因BZLF1和BALF4表達載體共轉染細胞293HEK/p2089細胞(本課題組前期利用基于BAC的EBV基因組,BAC-EBV,構建的穩(wěn)定細胞系),誘導293HEK/p2089產生EB病毒顆粒,其帶有用于真核細胞篩選的潮霉素抗性基因(hyg)。這些EB病毒顆粒經細胞與細胞接觸感染的方法,在B淋巴細胞的介導下,感染EBV陰性的鼻咽癌上皮細胞系。通過GFP可視化觀察與RT-PCR檢測EBV基因LMP1和LMP2的結果,表明,在本室成功建立EBV體外感染鼻咽癌上皮細胞系的方法。但是,鼻咽癌上皮細胞對潮霉素敏感性強,難以建立穩(wěn)定的細胞系。因此,本研究設計了基于BAC的EBV基因組(BAC-EBV),將原有的潮霉素抗性基因修改為嘌呤霉素抗性基因(pac)。在載體pcDNA3.1(+)上,將兩端含有重組蛋白FLP識別位點(FRT)的卡那霉素抗性基因(kan)與pac基因進行連接,兩端同時含有20bp與潮霉素抗性基因兩端同源的同源臂序列。連接后,通過常規(guī)的PCR和克隆方法,兩次延長兩端同源臂,使kan-pac兩端同源臂序列達到89bp。該同源臂延長后的線性片段通過PCR擴增,經電轉化、由λ噬菌體中redα(βγ系統(tǒng)介導在E.coli中發(fā)生同源重組(ET克隆),從而用kan-pac替代了BAC-EBV(p2089)中相應的hyg基因。然后通過重組蛋白FLP對FRT-kan-FRT特異性的識別,切除了引入的kan基因,留下69bp的FRT“疤痕”。利用相同的方法,將前期工作中已經在BAC-EBV基礎上切除EBV基因組的空白對照質粒pM-BAC中潮霉素抗性基因修改為嘌呤霉素基因。通過抗性篩選、對菌液進行PCR擴增、測序以及酶切的實驗方法鑒定抗性基因修改,結果表明,成功構建質粒BAC-EBV/pac與pM-BAC/pac。在此基礎上,將BAC-EBV/pac與pM-BAC/pac,轉染至293HEK細胞,建立EBV感染的上皮細胞系及相應的空白對照細胞系。本研究為在EBV相關的鼻咽癌研究中細胞模型的建立打下了基礎。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【共引文獻】

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本文編號：1207465