本文關(guān)鍵詞：鹽酸椒苯酮胺對慶大霉素致豚鼠耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

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【摘要】：研究背景 聽力障礙是耳鼻喉科常見疾病,據(jù)2013年世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全世界有3.6億人遭受殘疾性聽力損失困擾,占全球人口的5.3%,其中三分之二在發(fā)展中國家。中國是世界上最大的發(fā)展中國家,聽力障礙殘疾人有2057萬,占全國人口的16.79‰,為各類殘疾之首,其嚴(yán)重影響公眾身體健康和生活質(zhì)量。因此,能否找到有效的方法預(yù)防和治療聽力損傷是我們目前面臨的巨大挑戰(zhàn)。 聽力障礙包括傳導(dǎo)性耳聾、感音神經(jīng)性耳聾及混合性耳聾,絕大部分患者為感音神經(jīng)性聾。目前認(rèn)為其發(fā)病原因有,缺血、藥物耳毒性、遺傳、老年性、噪聲性、病毒感染、自身免疫疾病、聽神經(jīng)病、中樞疾病、腫瘤等。感音神經(jīng)性聾是內(nèi)耳及其神經(jīng)傳導(dǎo)通路一系列病變所致聽力損失的總稱,病理改變主要是毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)、突觸復(fù)合體、耳蝸神經(jīng)及聽中樞等器質(zhì)性改變。 內(nèi)耳包含兩種類型的感受器細(xì)胞：內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cell,IHC)和外毛細(xì)胞(outer hair cell,OHC),可將機(jī)械能轉(zhuǎn)換為生物電能(細(xì)胞感受器電位),螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是傳入神經(jīng)元,將感受器電位激發(fā)形成的神經(jīng)動(dòng)作電位傳入中樞,形成聽覺或位置覺。內(nèi)、外毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)的I型、II型傳入神經(jīng)元樹突分別形成傳入突觸。內(nèi)毛細(xì)胞可將不同頻率、強(qiáng)度的聲音信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào),形成電勢能,刺激突觸前膜釋放神經(jīng)遞質(zhì)到相應(yīng)的螺旋神經(jīng)元,再由螺旋神經(jīng)元投射到中樞神經(jīng)系統(tǒng),形成聽覺。外毛細(xì)胞對聲音信號(hào)具有放大作用,使耳蝸對聲音頻率有高度的敏感性和選擇性,以輔助內(nèi)毛細(xì)胞。耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞傳入突觸的數(shù)量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能異常會(huì)導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾。因此,在聲音信號(hào)的傳遞過程中,毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)等傳入神經(jīng)通路的任何部位損傷都將引起感音神經(jīng)性聾。耳蝸是高耗能組織,在缺血缺氧時(shí)可引起毛細(xì)胞壞死、傳入神經(jīng)腫脹導(dǎo)致聽力障礙；噪聲也可傷害耳蝸毛細(xì)胞及傳入神經(jīng)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),氨基糖苷類抗生素可以導(dǎo)致外毛細(xì)胞纖毛損害,甚至外毛細(xì)胞本身的損害和死亡,并且也有研究表示其可直接或間接導(dǎo)致螺旋神節(jié)細(xì)胞凋亡壞死。缺血再灌注、噪聲、藥物中毒都是感音神經(jīng)性聾的常見原因,但是有研究指出缺血5min后傳入神經(jīng)腫脹,再灌注后傳入神經(jīng)損傷逐漸恢復(fù)至正常；而AmAn的耳毒性呈持續(xù)性,即使停藥也不能阻止聽力損害,更利于我們觀察一些預(yù)防和治療措施對耳蝸損傷所起的作用。本實(shí)驗(yàn)通過常見的氨基糖苷類抗生素(Aminoglycoside antibiotics,AmAn)--慶大霉素(Gentamicin,GM),建立耳毒性藥物致感音神經(jīng)性聾的動(dòng)物模型。 AmAn耳毒性發(fā)生率高,并且此損傷是不可逆的,在兒童、老人及免疫力低下者中其耳毒性發(fā)生率更高。毒性作用使AmAn在臨床應(yīng)用中受到一定程度限制,但是AmAn在治療嚴(yán)重感染如敗血癥、泌尿道感染、革蘭陰性菌引起的腹內(nèi)感染,與β-內(nèi)酰胺類聯(lián)合治療心內(nèi)膜炎等仍有特殊價(jià)值；耳科用其鼓室內(nèi)注射治療梅尼埃病；目前有研究表明AmAn可抑制HIV復(fù)制的活性,這使得AmAn的很多應(yīng)用不可替代。慶大霉素是由小單飽菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種殺菌力較強(qiáng)的廣譜抗生素,臨床應(yīng)用較廣泛,由于其肝腎毒性較其他AmAn,所以是制造感音神經(jīng)性聾動(dòng)物模型的理想藥物。 慶大霉素進(jìn)入內(nèi)耳后主要集中于內(nèi)耳淋巴液,其產(chǎn)生毒性的靶細(xì)胞是毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。目前認(rèn)為GM損傷耳蝸結(jié)構(gòu)主要圍繞線粒體損傷,細(xì)胞凋亡,氧自由基及鈣超載。GM損傷線粒體是通過阻斷70S核糖體循環(huán)導(dǎo)致蛋白合成障礙,破壞線粒體膜功能,造成線粒體能量供應(yīng)障礙；線粒體損傷使膜轉(zhuǎn)換電子能力降低,形成大量氧自由基,誘發(fā)耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)物(reactive oxygen species,ROS)。氧自由基和鈣超載除直接造成細(xì)胞損傷外還可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。有研究指出,細(xì)胞凋亡是氨基糖苷類抗生素致聾的主要方式,可通過多條途徑實(shí)現(xiàn),但大部分最終都依賴于Caspase-3的活化,Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。GM在內(nèi)耳淋巴液中半衰期較長,可被耳蝸毛細(xì)胞攝取入胞內(nèi),通過上述機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡壞死。毛細(xì)胞可與螺旋神經(jīng)節(jié)樹突構(gòu)成突觸連接,是傳入神經(jīng)的“營養(yǎng)供給站”,其釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸等),使神經(jīng)末梢保持活力,毛細(xì)胞被破壞,傳入神經(jīng)及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏營養(yǎng)而發(fā)生延遲性死亡。 目前認(rèn)為在哺乳動(dòng)物中,毛細(xì)胞損傷后再生困難,通過毛細(xì)胞再生及耳蝸干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性耳聾的方法仍在探索中。傳入神經(jīng)系統(tǒng)損傷是導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的一個(gè)重要病理改變,傳入神經(jīng)系統(tǒng)包括突觸復(fù)合體、神經(jīng)末梢及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等,突觸結(jié)構(gòu)很容易受外界環(huán)境影響導(dǎo)致其功能的異常,螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損后也難以修復(fù)。雖有實(shí)驗(yàn)表明,傳入神經(jīng)損傷后神經(jīng)纖維可再生并和毛細(xì)胞形成聯(lián)系；且螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡后周圍的施萬細(xì)胞增殖,但其不能分化成正常功能的神經(jīng)元細(xì)胞來發(fā)揮作用。目前臨床上可通過佩戴助聽器和人工耳蝸移植來輔助感音神經(jīng)性聾患者獲得部分聽力,但是由于習(xí)慣勢力及經(jīng)濟(jì)原因?qū)е缕洳荒軓V泛使用,大部分患者仍依賴藥物治療。因此,對藥物治療感應(yīng)神經(jīng)性聾的探索是耳科研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。 鹽酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride, PPTA),是我國自主創(chuàng)新研發(fā)的鈣增敏劑類強(qiáng)心藥及心肌保護(hù)劑,已獲得3個(gè)發(fā)明專利,11類化學(xué)藥品臨床試驗(yàn)批件,且已經(jīng)完成了127例Ⅰ期臨床試驗(yàn)。臨床前研究表明其不僅具有保護(hù)受損心肌、增強(qiáng)心功能并能降低心肌耗氧量的雙重作用；還可通過增加SOD活性及GSH含量,減少NO含量,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,并且可降低缺血腦組織Caspase-3mRNA的表達(dá),表現(xiàn)出良好的抗凋亡作用。與心腦組織損傷類似,鈣超載、自由基、細(xì)胞凋亡也是耳蝸損傷的常見原因,PPTA對心腦的保護(hù)機(jī)制為本研究提供了方向。 本研究第一部分分別建立豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷模型及慶大霉素致豚鼠耳毒性動(dòng)物模型,通過聽性腦干反應(yīng)(ABR)、聽毛細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的變化,掃描電鏡觀察兩種模型內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的改變,在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷的動(dòng)物模型更適合于觀察耳蝸損傷；第二部分我們通過建立慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷模型以觀察PPTA對耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用,通過聽性腦干反應(yīng)(ABR)、毛細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶染色、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記技術(shù)(ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing,TUNEL)、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western blot)、透射電鏡等方法檢測ABR閾值、Caspase-3蛋白表達(dá)、聽毛細(xì)胞內(nèi)線粒體功能狀態(tài)、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)及內(nèi)耳細(xì)胞凋亡和壞死等形態(tài)學(xué)變化,探討GM的耳毒性機(jī)理及PPTA對耳蝸損傷的保護(hù)機(jī)制,為感音神經(jīng)性聾藥物治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究分為以下兩個(gè)部分 第一部分豚鼠耳蝸損傷模型的建立 目的 選擇合適的耳蝸損傷模型以便下一步觀察PPTA對耳蝸損傷的保護(hù)作用。方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康純白赤目豚鼠36只,隨機(jī)分為3組,8只用于實(shí)驗(yàn),4只備用：空白對照組(control group,A組)、缺血再灌注組(I/R group,B組)、慶大霉素組(GM group,C組)。 1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立：A組不做任何處理；B組2%戊巴比妥鈉麻醉后,頸前正中逐層切開皮膚及皮下組織,分離出雙側(cè)椎動(dòng)脈和右側(cè)頸總動(dòng)脈,無創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾住血管,1h后松開再灌注；C組肌肉注射慶大霉素,120mg/kg/d,7d. 1.3實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)觀察：聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)分析造模前及造模后1、7d各組豚鼠聽力變化；ABR測量結(jié)束后,迅速處死豚鼠,斷頭取右側(cè)聽泡,暴露耳蝸蝸軸,運(yùn)用基底膜平鋪技術(shù),Nachlas氏四唑藍(lán)法顯示聽毛細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase, SDH)活性、并輔以掃描電鏡觀察形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果 1、ABR反應(yīng)閾：A組各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異(P=0.104,0.05)；B、C組造模后1d、7d與造模前有顯著差異(P0.05)；B組在造模7d后有所好轉(zhuǎn),C組聽力呈持續(xù)性下降。2、形態(tài)學(xué)變化：A組聽毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶著色均勻、無缺失,細(xì)胞形態(tài)正常。B組：毛細(xì)胞排列稍紊亂,著色較均勻；透射電鏡下可見外毛細(xì)胞纖毛倒伏、缺失,細(xì)胞間有裂隙,形態(tài)辨別不清。C組部分聽毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶未著色,電鏡下見細(xì)胞死亡、形態(tài)破壞嚴(yán)重。 結(jié)論 缺血再灌注組再灌注后一段時(shí)間內(nèi)聽力有所恢復(fù),而慶大霉素對毛細(xì)胞呈持續(xù)性損害作用,因此慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷模型適合于進(jìn)一步觀察PPTA對耳蝸損傷的保護(hù)作用。 第二部分鹽酸椒苯酮胺對慶大霉素致豚鼠耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究 目的 研究鹽酸椒苯酮胺對慶大霉素致耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。 方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康純白赤目豚鼠36只,隨機(jī)分3組,每組12只：空白對照組(control group)、慶大霉素組(GM group)和鹽酸椒苯酮胺組(PPTA group)。 1.2各實(shí)驗(yàn)組藥物應(yīng)用：GM組用慶大霉素100mg/kg/d,肌肉注射,14d; PPTA組用慶大霉素致聾并靜脈注射PPTA,10mg/kg/d,14d;空白對照組用等量生理鹽水肌肉注射。 1.3實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)觀察：聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)分析實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)14d天后聽力閾值及Ⅰ波潛伏期變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,迅速斷頭取雙側(cè)聽泡,左側(cè)耳蝸用Western blot檢測組織中Caspase-3蛋白表達(dá)；右側(cè)6只耳蝸用TUNEL染色觀察耳蝸細(xì)胞凋亡情況,并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)；剩余右側(cè)耳蝸分別觀察毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶染色及透射電鏡觀察形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果 1、ABR反應(yīng)閾：實(shí)驗(yàn)結(jié)束,正常組、GM組、PPTA組閾值分別為14.58±1.16dB、65.95±1.17dB、36.13±1.17dB,各組間聽力閾值變化率有顯著差異(P0.05)；Ⅰ波PL分別為1.094±0.028、1.667±0.028、1.254±0.028；各組間聽力閾值變化率有顯著差異(P0.05)；。2、凋亡指數(shù)：螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞率分別為0.02±0.00、0.45±0.03、0.16±0.02,各組間有顯著差異(P0.05)；3、耳蝸Caspase-3蛋白表達(dá)：各組Caspase-3表達(dá)分別為1.09±0.11、2.55±0.20、1.67±0.07,各組間有顯著差異(P0.05)；4、毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶染色：對照組毛細(xì)胞著色深,均勻；GM組14d后毛細(xì)胞大量死亡；PPTA組部分外毛細(xì)胞著色淺,整體顏色淺。TUNEL染色及透射電鏡觀察：GM組螺旋神經(jīng)節(jié)存在大量凋亡細(xì)胞形態(tài),核固縮；神經(jīng)纖維脫髓鞘改變,PPTA組以上損傷情況較GM組減輕。 結(jié)論 PPTA對慶大霉素豚鼠耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R764.4

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號(hào)：1139585