本文關(guān)鍵詞：miR-182在耳蝸前體細胞增殖和分化中的作用及機制研究

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【摘要】：成年哺乳動物毛細胞缺乏自發(fā)再生的能力，所以隨著時間推移，受年齡、疾病、外傷等因素的損傷，毛細胞數(shù)量會逐漸減少，當(dāng)減少到一定程度后，就會出現(xiàn)聽力下降，導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。近年來，利用干細胞（stem cells）進行替代治療成為毛細胞再生的研究熱點。 耳蝸前體細胞（Cochlear progenitor cells，CPCs）是指胚胎和新生哺乳動物耳蝸中存在的具有干細胞特點的細胞，在體外具有自我更新能力，可傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化后可表達毛細胞或支持細胞特異性標志物，其中毛細胞樣細胞具有毛細胞纖毛樣結(jié)構(gòu)。與神經(jīng)干細胞（NSCs）相比較，耳蝸前體細胞在毛細胞再生研究方面具有很大的優(yōu)勢：首先，耳蝸前體細胞更容易分化成為毛細胞樣細胞；其次，耳蝸前體細胞分化為毛細胞標志物陽性的細胞比例更高，達10%以上。因此，耳蝸前體細胞是目前替代損傷耳蝸毛細胞的最佳候選細胞。 microRNA （miRNA）是一類非編碼小分子RNA，具有高度的保守性，廣泛存在于哺乳動物基因組中，調(diào)控著超過半數(shù)脊椎動物mRNA的表達。研究發(fā)現(xiàn)miRNA183家族（包括miR-182/96/183）在出生后小鼠的內(nèi)耳毛細胞中特異性表達，并在毛細胞的分化過程中高表達。其中，miR-182在具有增殖能力的耳蝸前體細胞（CPCs）中水平較高，而在細胞分化的過程中miR-182表達逐漸下降，且miR-182的表達水平在未分化的NSCs中顯著低于CPCs。我們認為miR-182可能同時參與耳蝸毛細胞的增殖及分化調(diào)控，具有促進耳蝸毛細胞再生的潛能。 實驗一大鼠耳蝸前體細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及體外誘導(dǎo)分化模型的建立 目的成年哺乳動物耳蝸毛細胞一旦損傷后不能自發(fā)再生，這是導(dǎo)致感應(yīng)神經(jīng)性耳聾的主要原因。通過對耳蝸毛細胞分化、調(diào)控機制的研究，也許可以幫我們找到毛細胞再生的新途徑。目前還沒有建立起能穩(wěn)定傳代的毛細胞細胞系及前體細胞細胞系。我們建立了耳蝸前體細胞體外分離、培養(yǎng)的體系，并在體外成功誘導(dǎo)分化產(chǎn)生毛細胞樣細胞，為研究毛細胞再生提供了切實可行的細胞模型。 方法從新生大鼠耳蝸中分離培養(yǎng)耳蝸前體細胞，進行原代培養(yǎng)，并用血清誘導(dǎo)分化。BrdU、Nestin免疫熒光染色鑒定細胞自我增殖能力；myosin Ⅶa和phalloidin免疫熒光染色鑒定其分化為毛細胞的潛能。 結(jié)果耳蝸前體細胞體外培養(yǎng)，第二天即形成大量細胞球，，懸浮生長。收集懸浮的細胞球行免疫熒光染色，細胞球內(nèi)大量細胞BrdU、Nestin陽性。體外誘導(dǎo)耳蝸前體細胞分化，分化細胞表達myosin Ⅶa、phalloidin等毛細胞標志物，在電鏡下可見細胞表面有纖毛樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論本研究證實在新生大鼠耳蝸內(nèi)存在具有增殖、分化能力的耳蝸前體細胞，這種前體細胞可以體外培養(yǎng)，并可誘導(dǎo)分化產(chǎn)生毛細胞樣細胞。提示我們所建立的這個細胞培養(yǎng)體系可以用來研究毛細胞的功能，也可以用來研究毛細胞的再生。 實驗二miR-182在耳蝸前體細胞增殖中的作用及其可能機制 目的黑任軼等[39]在實驗中觀察到miR-182在耳蝸前體細胞未分化階段出現(xiàn)表達量的峰值，隨后其表達量隨著細胞的分化進行而逐漸下降。為進一步研究miR-182對前體細胞增殖期的作用及其機制，我們應(yīng)用過表達及基因沉默技術(shù)，向前體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-182的模擬物（mimics）及inhibitor，觀察miR-182過表達及低表達后對耳蝸前體細胞增殖凋亡的影響，并檢測細胞中部分相關(guān)基因蛋白表達量的變化。 方法從新生大鼠耳蝸中分離培養(yǎng)耳蝸前體細胞，進行增殖培養(yǎng)。分別利用miR-182mimics和inhibitor在新生大鼠耳蝸前體細胞中過表達和低表達miR-182，然后繼續(xù)增殖培養(yǎng)4天后，用流式細胞儀檢測各組耳蝸前體細胞的細胞周期及凋亡，用RT-PCR、Western-blot檢測部分基因及蛋白的變化。 結(jié)果使用miR-182mimics進行過表達后，耳蝸前體細胞中P27kip1、FoxO1、FoxO3表達量增加，細胞增殖能力減弱。使用inhibitor進行低表達，結(jié)果相反。 結(jié)論過表達miR-182可以抑制耳蝸前體細胞增殖，P27kip1、FoxO1、FoxO3等可能是其間接靶基因。外源性miR-182mimics可以抑制耳蝸前體細胞的增殖，在耳蝸前體細胞未分化階段miR-182出現(xiàn)表達量的峰值，其作用可能是為了限制耳蝸前體細胞的增殖能力，防止細胞的過度增加。 實驗三miR-182在耳蝸前體細胞分化中的作用及其可能機制 目的探討miR-182誘導(dǎo)耳蝸前體細胞向毛細胞分化的作用及機制。 方法從新生大鼠耳蝸中分離培養(yǎng)耳蝸前體細胞并用分組血清誘導(dǎo)分化，分別利用miR-182mimics和inhibitor在新生大鼠耳蝸前體細胞中過表達和低表達miR-182，然后細胞誘導(dǎo)分化7天后，用流式細胞儀檢測分化細胞中myosinⅦa陽性細胞比例，用Western-blot檢測相關(guān)分子Sox2、Hes1、p27kip1、math1的變化。 結(jié)果使用miR-182mimics進行過表達后，耳蝸前體細胞分化為myosinⅦa陽性表達的細胞比例高于對照組，使用miR-182inhibitor進行低表達后此比例低于對照組。Western-blot檢測顯示Sox2、Hes1、p27kip1在miR-182mimics組較對照組降低，miR-182inhibitor組較對照組增加。math1在miRNA182mimics組增高，在inhibitor組減少。 結(jié)論過表達miRN182可以促進耳蝸前體細胞向毛細胞方向分化，Sox2、Hes1可能是此過程中的靶基因。外源性的miR-182可以促進耳蝸前體細胞向毛細胞樣細胞分化，高表達或者沉默miR-182，可以使Sox2、Hes1、p27kip1、math1等發(fā)生變化，與我們的預(yù)測結(jié)果一致。但是，miR-182是否通過調(diào)控Sox2、Hes1、p27kip1、math1等來調(diào)控毛細胞的分化，其機制還有待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：耳蝸前體細胞 原代培養(yǎng) 分化 毛細胞 miR-182
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764.431
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-22
• 耳蝸毛細胞再生的研究進展13-19
• MicroRNA183 家族與耳蝸發(fā)育相關(guān)研究進展19-22
• 實驗一 大鼠耳蝸前體細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及體外誘導(dǎo)分化模型的建立22-33
• 前言22-23
• 1 材料23-24
• 2 方法24-28
• 3 結(jié)果28-31
• 4 討論31-33
• 實驗二 miR-182 在耳蝸前體細胞增殖中的作用及其可能機制33-57
• 前言33-34
• 1 材料34-35
• 2 方法35-42
• 3 結(jié)果42-51
• 4 討論51-57
• 實驗三 miR-182 在耳蝸前體細胞增殖中的作用及其可能機制57-69
• 前言57
• 1 材料57-59
• 2 方法59-60
• 3 結(jié)果60-66
• 4 討論66-69
• 小結(jié)69-70
• 參考文獻70-76
• 個人簡歷和研究成果76-77
• 致謝77

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 鐘翠萍;馬東洋;韓宇;徐學(xué)海;馬敬;朱友平;邱建華;陳陽;;新生大鼠耳蝸前體細胞的培養(yǎng)及鑒定[J];中華耳科學(xué)雜志;2011年02期

2 李華偉;內(nèi)耳毛細胞再生前體細胞的來源、激活及調(diào)節(jié)因素[J];聽力學(xué)及言語疾病雜志;1998年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 黑任軼;microRNA在耳蝸前體細胞增殖和分化中的作用探討[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 鐘翠萍;c-Myc及CyclinA2基因誘導(dǎo)大鼠耳蝸前體細胞增殖的體外研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

本文編號：1074883