本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性復(fù)發(fā)自身免疫性葡萄膜炎作用的研究

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【摘要】：目的葡萄膜炎是常見的致盲性眼病,病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,多種類型反復(fù)發(fā)作,治療棘手。實(shí)驗(yàn)性復(fù)發(fā)自身免疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型(recurrent experimental autoimmune uveitis, rEAU)具有與人類慢性復(fù)發(fā)性葡萄膜炎相一致的臨床特征,是研究葡萄膜炎病理機(jī)制和探索新型治療方法的重要工具。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種具有免疫抑制特性的多能成體干細(xì)胞,在體內(nèi)外可抑制多種免疫細(xì)胞的增殖和功能。本實(shí)驗(yàn)研究MSCs對(duì)rEAU的治療效果,觀察臨床及病理表現(xiàn),檢測(cè)脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力以及脾臟、頸部引流淋巴結(jié)和眼部輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T lymphocyte,Th)17的比例,以闡明MSCs對(duì)rEAU的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,為臨床治療葡萄膜炎提供新的方法和理論基礎(chǔ)。 方法 1. MSCs培養(yǎng),分離純化并鑒定Wistar大鼠骨髓MSCs。 2.rEAU模型建立：光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein, IRBP)多肽片段R16與含有結(jié)核桿菌素H37RA2.5g/l的弗氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant, CFA)等體積混合充分乳化,單側(cè)后肢足墊皮下注射,免疫Lewis大鼠建立EAU動(dòng)物模型。免疫后第10天取EAU大鼠脾臟及引流淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞,R16抗原刺激條件下體外培養(yǎng)48小時(shí),將1×107活化T淋巴細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至Lewis大鼠建立rEAU動(dòng)物模型。 3. MSCs治療：24只rEAU大鼠隨機(jī)分為PBS對(duì)照組和MSCs治療組。過繼免疫后第4天,即首次發(fā)病初發(fā)期,MSCs治療組每日行5×106MSCs尾靜脈注射治療,PBS對(duì)照組行等體積PBS注射,連續(xù)3天。 4.臨床觀察：過繼免疫后,每日在裂隙燈顯微鏡下觀察rEAU大鼠眼部前節(jié)炎癥反應(yīng),并根據(jù)Caspi I臨床分級(jí)進(jìn)行評(píng)分至第50天,即疾病慢性期。 5.組織病理學(xué)觀察：過繼免疫后第50天,處死rEAU大鼠并摘取雙側(cè)眼球制備視網(wǎng)膜組織切片,HE染色后行組織病理學(xué)觀察。 6.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, Brdu)測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖：過繼轉(zhuǎn)移后第10天,即首次發(fā)病恢復(fù)期,取rEAU大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞,不同濃度梯度(0、0.3、1、10μg/ml)R16抗原刺激條件下體外培養(yǎng)48小時(shí),Brdu標(biāo)記,繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí),加入Brdu抗體及顯色工作液,酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。計(jì)算T淋巴細(xì)胞刺激增殖指數(shù)。 7.流式細(xì)胞分析CD4、白介素(mterleukin, IL-)-17陽性細(xì)胞：過繼轉(zhuǎn)移后第10天,即首次發(fā)病恢復(fù)期,分離rEAU大鼠脾臟、頸部引流淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞及眼部細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,小鼠抗大鼠CD4、IL-17熒光抗體染色,流式細(xì)胞儀分析CD4+IL-17+細(xì)胞比例。 結(jié)果 1.成功分離純化并鑒定大鼠MSCs。 2.成功建立大鼠rEAU模型。 3.臨床觀察顯示,MSCs治療降低rEAU50天內(nèi)的臨床平均分(P0.05),減少發(fā)病次數(shù)(P0.05),減低首次發(fā)病病程中的臨床評(píng)分(P0.05)。 4.組織病理學(xué)觀察顯示,50天后眼部呈慢性炎癥狀態(tài),MSCs治療能夠減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的損傷。 5.Brdu測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖顯示,脾臟T淋巴細(xì)胞增殖呈R16抗原依賴性,MSCs治療能夠抑制R16抗原特異性T淋巴細(xì)胞增殖的能力(P0.05)。 6.流式細(xì)胞分析CD4+IL-17+細(xì)胞顯示,MSCs治療能夠降低脾臟、頸部引流淋巴結(jié)CD4+IL-17+細(xì)胞比例(P0.05),減少CD4+IL-17+細(xì)胞向眼部的浸潤(rùn)(P0.05)。 結(jié)論rEAU的發(fā)生發(fā)展與活化的R16抗原特異性T淋巴細(xì)胞密切相關(guān),Thl7細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17參與炎癥過程。MSCs治療可以有效減輕rEAU的臨床及病理表現(xiàn),其機(jī)制可能與抑制R16抗原特異性T淋巴細(xì)胞增殖能力,減少脾臟、頸部引流淋巴結(jié)及眼部Thl7細(xì)胞相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)性復(fù)發(fā)自身免疫性葡萄膜炎 T淋巴細(xì)胞增殖 Th17細(xì)胞 流式細(xì)胞分析
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R773.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號(hào)說明10-11
• 前言11-16
• 研究現(xiàn)狀、成果11-14
• 研究目的、方法14-15
• 主要技術(shù)路線15-16
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料和方法16-24
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-35
• 2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)培養(yǎng)與鑒定24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)性復(fù)發(fā)自體免疫性葡萄膜炎(rEAU)動(dòng)物模型構(gòu)建25-27
• 2.3 MSCs減輕rEAU臨床表現(xiàn)27-31
• 2.4 MSCs改善rEAU組織病理學(xué)表現(xiàn)31-32
• 2.5 MSCs抑制抗原特異性T淋巴細(xì)胞增殖32-33
• 2.6 MSCs下調(diào)輔助性T細(xì)胞(Th)1733-35
• 3. 討論35-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明47-48
• 綜述48-58
• 綜述參考文獻(xiàn)54-58
• 致謝58

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1075234