本文關(guān)鍵詞：鼻咽癌發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因篩選及Annexin A6基因在鼻咽癌中的表達(dá)研究

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【摘要】：目的：首先以永生化的鼻咽上皮細(xì)胞株(NP69)和鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)細(xì)胞株(6-10B、5-8F)為研究模型,從蛋白表達(dá)譜入手,采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選NPC中發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因。而后從發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因中選取Annexin A6(ANXA6)為研究對象,檢測ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69細(xì)胞株中的甲基化情況,初步闡明ANXA6在NPC中表達(dá)下調(diào)的部分機制以及在NPC中的作用。 方法：培養(yǎng)永生化的鼻咽上皮細(xì)胞NP69和NPC細(xì)胞6-10B、5-8F,分別抽提蛋白質(zhì),測量蛋白濃度,采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)的方法分離鑒定三株細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白,實驗重復(fù)兩次。通過ProteinPilotTM4.2軟件進行Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫搜索及鑒定,從中篩選出6-10B和5-8F兩株NPC細(xì)胞相對NP69表達(dá)都下調(diào)的差異蛋白,并進行生物信息學(xué)分析。進一步挑選ANXA6基因采用qRT-PCR (Quantitative Reverse transcriptase Polymerase chain reaction)檢測5-8F、6-10B和NP69中mRNA的表達(dá)水平；采用蛋白印跡法(Western Blotting)驗證ANXA6蛋白在5-8F、6-10B和NP69三株細(xì)胞中的表達(dá)水平；采用免疫組織化學(xué)檢測ANXA6蛋白在NPC組織和鼻咽上皮組織中的表達(dá)情況,同時統(tǒng)計分析NPC中ANXA6蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系；采用亞硫酸氫鹽測序法檢測ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69細(xì)胞株中的甲基化情況。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：根據(jù)篩選條件,篩選出兩株NPC細(xì)胞相對NP69低表達(dá)的差異蛋白98個,經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白通過多種信號通路在鼻咽癌發(fā)生過程中發(fā)揮作用。挑選ANXA6進一步研究,qPCR和Western blotting結(jié)果顯示mRNA和蛋白表達(dá)情況與iTRAQ的結(jié)果一致：NP69表達(dá)高于6-10B,6-10B表達(dá)高于5-8F,兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義；免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)ANXA6在NPC組織中表達(dá)低于鼻咽上皮組織(P0.001),且ANXA6蛋白表達(dá)水平與NPC的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)；亞硫酸氫鹽修飾后基因測序發(fā)現(xiàn)NP69細(xì)胞ANXA6基因無甲基化,而6-10B和5-8F存在不同程度的甲基化,其甲基化百分比分別為25.6%、17.9%, NP69與6-10B和5-8F比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而6-10B與5-8F比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：1、本研究以NPC細(xì)胞株5-8F、6-10B和永生化的鼻咽上皮細(xì)胞株NP69為研究模型,采用iTARQ結(jié)合2DLC-MS/MS的方法篩選出NPC發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因98個。 2、ANXA6蛋白在細(xì)胞NP69.6-10B.5-8F中表達(dá)依次下降,且鼻咽上皮組織、未轉(zhuǎn)移NPC組織、轉(zhuǎn)移NPC組織表達(dá)依次下降。據(jù)此推測,ANXA6蛋白表達(dá)下調(diào)可能與NPC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 3、ANXA6表達(dá)下調(diào)/缺失與NPC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān),ANXA6表達(dá)下調(diào)/缺失的NPC更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,臨床分期更晚。 4、在NPC中ANXA6基因甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)/缺失的重要原因之一,同時在轉(zhuǎn)錄水平還有其他的機制參與調(diào)控ANXA6的表達(dá)。 5、ANXA6可能是NPC的抑癌基因。圖8幅,表8個,參考文獻(xiàn)53篇
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 ANXA6 甲基化 iTRAQ 亞硫酸氫鹽測序法
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 英文~.略詞表12-13
• 第一章 鼻咽癌發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因篩選13-27
• 1.1 緒論13-14
• 1.2 材料與方法14-19
• 1.2.1 主要實驗材料14-16
• 1.2.2 實驗方法16-19
• 1.3 結(jié)果19-26
• 1.3.1 篩選鼻咽癌發(fā)生相關(guān)下調(diào)蛋白19-23
• 1.3.2 生物信息學(xué)分析23-26
• 1.4 討論26-27
• 第二章 Annexin A6基因在鼻咽癌中的表達(dá)研究27-51
• 2.1 緒論27-28
• 2.2 材料與方法28-41
• 2.2.1 主要實驗材料28-33
• 2.2.2 實驗方法33-41
• 2.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析41
• 2.3 結(jié)果41-49
• 2.3.1 qRT-PCR檢測ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69中mRNA表達(dá)水平41-43
• 2.3.2 蛋白濃度測定結(jié)果43
• 2.3.3 Western blotting驗證ANXA6在三株細(xì)胞中的表達(dá)43-44
• 2.3.4 免疫組化染色檢測ANXA6在鼻咽癌組織和非癌組織中的表達(dá)44-46
• 2.3.5 ANXA6甲基化檢測結(jié)果46-49
• 2.4 討論49-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-70
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要的研究成果70-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1055680