本文關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒感染的抑制性分子篩選及作用機(jī)制研究

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【摘要】：【研究背景與目的】丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球重要的公共衛(wèi)生問題,影響著全世界約3%的人口,每年導(dǎo)致超過35萬的死亡病例。HCV感染慢性化程度非常高,病程進(jìn)展隱匿,終末期患者常伴有慢性肝疾病的發(fā)生,包括肝脂肪變性、肝纖維化,甚至發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌。目前,并無有效的預(yù)防性或治療性疫苗問世。早期治療HCV感染一般采用聚乙二醇干擾素加利巴韋林,療效在不同基因型中差別較大、治療時(shí)限較長(zhǎng)、不良反應(yīng)較多。近幾年,針對(duì)HCV生命周期中特定病毒蛋白的靶向性藥物,又稱直接作用的抗病毒藥物(DAA)得到了飛速的發(fā)展,有效提高了治療患者的持續(xù)病毒應(yīng)答率(SVR)。然而,DAA的使用仍舊受到一些問題的限制,如耐藥突變的產(chǎn)生、藥物附帶的一些不良反應(yīng)、不可忽視的高昂治療費(fèi)用等。因此,對(duì)HCV感染過程的進(jìn)一步研究,包括研制針對(duì)病毒生命周期不同階段的新型藥物,及解析病毒與宿主相互作用中的關(guān)鍵分子等,都將加深我們對(duì)HCV感染機(jī)制的認(rèn)識(shí),也為發(fā)展更高效、耐受性更好的抗HCV藥物提供研究基礎(chǔ)與助力。HCV的感染包括病毒顆粒的入侵、病毒基因組的翻譯與復(fù)制、成熟病毒顆粒的組裝與釋放這些步驟。目前上市的DAA藥物主要通過抑制病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的成熟或酶的活性進(jìn)而阻斷病毒復(fù)制的過程。然而,這些藥物由于靶向高度變異的病毒成分,其基因屏障相對(duì)較低,且難以起到預(yù)防感染的作用,這也是HCV終末期患者肝移植后的病毒再感染率居高不下的一個(gè)原因。HCV入侵是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的多步驟過程,包括病毒的非特異性結(jié)合、與靶細(xì)胞入侵相關(guān)受體的相互作用、病毒內(nèi)吞入靶細(xì)胞及與宿主細(xì)胞間的膜融合。這個(gè)過程為抗HCV治療提供了許多新的靶點(diǎn),這些靶點(diǎn)由于多靶向宿主細(xì)胞成分,因此具有較高的基因屏障。由于入侵抑制劑干擾的是病毒生命周期最開始的階段,此時(shí)病毒基因組并未釋放,因此具有同時(shí)預(yù)防與治療病毒感染的作用。入侵抑制劑與目前的抗HCV藥物聯(lián)合運(yùn)用,即病毒生命周期多個(gè)階段的靶向聯(lián)合治療,可能成為未來抗HCV治療的一個(gè)主要方向。研發(fā)新型的覆蓋多基因型的高效HCV入侵抑制劑十分必要。HCV的感染會(huì)引起宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變,多種宿主因子的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。在這其中,一些分子表達(dá)水平的變化會(huì)進(jìn)一步影響病毒的感染過程。增進(jìn)對(duì)這類分子,尤其是具有抑制病毒感染作用分子的認(rèn)識(shí)和研究,將大大促進(jìn)抗HCV研究的發(fā)展。非編碼RNA(nc RNA)早前被認(rèn)為在細(xì)胞中并無實(shí)際功能。近幾年,隨著生物技術(shù)的發(fā)展及研究的深入,越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在各種的生理或病理過程中發(fā)揮著重要作用。其中對(duì)長(zhǎng)度小于200 bp的微小RNA(mi RNA)的研究較多,它的作用方式和機(jī)制目前已經(jīng)解析得較為透徹。在HCV感染中,較為熟悉的有mi R-122,它通過與病毒基因組5’UTR區(qū)域的相互作用促進(jìn)病毒的復(fù)制,其抑制劑目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。我室之前也有報(bào)道m(xù)i R-221通過靶向干擾素通路抑制性分子來增加IFN的抗HCV的活性。然而關(guān)于長(zhǎng)度大于200 bp長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lnc RNA)的研究仍處于初步階段,其在病毒感染中的研究更少之又少,在HCV感染中的作用更無報(bào)道。因此,研究lnc RNA在HCV感染中的作用將進(jìn)一步完善病毒與宿主相互作用過程的闡述,也為抗病毒藥物提供新的作用靶點(diǎn)。目前抗HCV治療藥物多為針對(duì)某一靶點(diǎn)人工合成的化合物,造價(jià)昂貴,并可能在人體中產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)。細(xì)胞療法是近期較為流行的治療方法之一,其中又以間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)療法最為常見,它可通過旁分泌一定的生物學(xué)活性物質(zhì)發(fā)揮作用。外泌體就是實(shí)現(xiàn)其旁分泌功能的主要介質(zhì)。研究顯示,外泌體既可在細(xì)胞間傳遞傳染性病原體也可以傳輸保護(hù)性物質(zhì)抑制病原體感染。已有報(bào)道稱HCV感染細(xì)胞分泌的外泌體可以傳遞具有感染性的病毒顆粒至其他細(xì)胞。然而,并無攜帶具有抗HCV物質(zhì)外泌體的報(bào)道。人干細(xì)胞來源的外泌體是生理培養(yǎng)下的人干細(xì)胞成分,生產(chǎn)成本較低,不良反應(yīng)也較少,是未來再生醫(yī)學(xué)的重要組成部分。因此,研究其在HCV感染過程中的作用具有現(xiàn)實(shí)意義。第一部分抗HCV活性天然化合物的篩選及機(jī)制研究方法:通過HCV體外感染模型,從數(shù)百種天然藥用植物來源的化合物中,高通量篩選出具有抗HCV活性的來源于保肝中藥五味子的四環(huán)三萜類化合物甘五酸(SZA)和來源于抗炎中藥絡(luò)石藤的木脂內(nèi)酯類化合物絡(luò)石藤苷元(TGN)。應(yīng)用不同基因型的單周期HCV假病毒顆粒及原代人肝細(xì)胞,初步分析化合物對(duì)病毒入侵的影響。繼而通過病毒動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),精確定位化合物抗HCV的有效靶點(diǎn)。采用密度梯度超速離心法分析化合物對(duì)病毒本身脂密度及感染性的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡及病毒結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)排除化合物對(duì)HCV靶細(xì)胞表面入侵相關(guān)受體的作用。以Di D介導(dǎo)的膜融合動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)研究SZA對(duì)入侵結(jié)合后的膜融合環(huán)節(jié)的作用,利用熒光染料Prodan檢測(cè)了SZA對(duì)脂質(zhì)膜流動(dòng)性的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TGN對(duì)結(jié)合到細(xì)胞表面的病毒E2含量的影響,設(shè)計(jì)CD81與HCV E2的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)TGN在其中的作用,利用預(yù)測(cè)軟件對(duì)TGN在CD81上的作用位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。測(cè)試SZA和TGN在細(xì)胞間病毒傳遞及與臨床上抗HCV藥物聯(lián)合運(yùn)用的效果。綜合分析SZA和TGN的抗HCV療效、作用靶點(diǎn)及靶向病毒生命周期的抗病毒機(jī)制。結(jié)果:SZA和TGN細(xì)胞毒性較小,可顯著抑制細(xì)胞來源的HCV(HCVcc)和HCV假病毒顆粒(HCVpp)感染靶細(xì)胞。SZA和TGN在不同型別的HCVpp中的抑制效果一致,并能阻斷HCVpp入侵原代人肝細(xì)胞。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)提示,兩者的作用靶點(diǎn)位于病毒感染早期入侵階段的結(jié)合后步驟。SZA和TGN對(duì)病毒本身的脂密度和RNA水平的分布,及細(xì)胞表面入侵受體表達(dá)量和病毒結(jié)合活性并無顯著影響。DID介導(dǎo)的膜融合動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)提示,SZA可能通過破壞病毒與細(xì)胞膜融合的過程抑制病毒感染。同時(shí),細(xì)胞脂質(zhì)膜的流動(dòng)性也在SZA的作用下升高。TGN則干擾了HCV E2蛋白與入侵關(guān)鍵分子CD81之間的相互作用,且分子預(yù)測(cè)軟件結(jié)果顯示,CD81大胞外環(huán)上的Thr166、Asn184、Lys187或Glu188與TGN形成的氫鍵可能在TGN抑制病毒入侵中發(fā)揮著重要作用。此外,SZA和TGN能顯著抑制細(xì)胞間病毒的傳遞,且與干擾素或VX-950聯(lián)合運(yùn)用后具有協(xié)同抑制病毒感染的效果。結(jié)論:天然植物來源的SZA和TGN具有顯著的抗HCV感染的活性。兩者的作用機(jī)制為干擾了HCV感染早期的必要步驟即病毒入侵,與目前傳統(tǒng)的DAA的治療靶點(diǎn)不同,可作為HCV感染預(yù)防及對(duì)現(xiàn)有療法的補(bǔ)充,具有廣闊的應(yīng)用前景。第二部分抗HCV長(zhǎng)鏈非編碼RNA的高通量篩選及機(jī)制研究方法:通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在HCV感染前后差異表達(dá)的系列Lnc RNA。其中,Lnc RNA GAS5所有轉(zhuǎn)錄體在HCV感染后都呈高表達(dá)。通過進(jìn)一步過表達(dá)或下調(diào)該Lnc RNA,發(fā)現(xiàn)GAS5的上調(diào)可以顯著抑制HCV的感染,下調(diào)則促進(jìn)感染。隨后,應(yīng)用單周期HCV假病毒顆粒,排除GAS5對(duì)病毒入侵的影響。通過轉(zhuǎn)染病毒RNA入靶細(xì)胞或利用HCV復(fù)制子細(xì)胞實(shí)驗(yàn),檢測(cè)GAS5對(duì)HCV復(fù)制的影響。構(gòu)建GAS5的不同截短體,通過觀察它們?cè)诓《靖腥局械淖饔?明確GAS5的功能序列。使用預(yù)測(cè)軟件分析可能與GAS5相互作用的蛋白,并從中挑選出與HCV感染尤其是復(fù)制相關(guān)的蛋白,利用RNA免疫共沉淀(RIP)技術(shù)明確兩者之間的相互作用。構(gòu)建缺失GAS5功能序列的截短體,進(jìn)一步明確這段序列的抑制作用。綜合評(píng)估GAS5抑制HCV感染的靶點(diǎn)和所涉及到的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果:GAS5在HCV感染細(xì)胞的胞質(zhì)中高表達(dá),并隨感染劑量的上升及感染進(jìn)展而升高。在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)GAS5,可顯著抑制HCVcc感染靶細(xì)胞;下調(diào)GAS5的水平則促進(jìn)病毒的感染。GAS5對(duì)不同基因型HCV假病毒顆粒(HCVpp)入侵靶細(xì)胞并無明顯抑制效果。在HCV復(fù)制子細(xì)胞中過表達(dá)GAS5后能顯著降低胞內(nèi)病毒RNA水平,干擾GAS5能提高病毒RNA的表達(dá)。GAS5的不同截短體,包括GAS5-251都能抑制病毒的感染。軟件預(yù)測(cè)GAS5前200 bp與HCV NS3可能存在相互作用。利用RIP技術(shù),將與GAS5相互作用的蛋白拉下,通過Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)GAS5可顯著拉下HCV NS3蛋白,提供了GAS5與病毒NS3蛋白相互作用的依據(jù)。缺失GAS5前200序列的截短體失去原有的抗HCV活性,進(jìn)一步證實(shí)了GAS5前200個(gè)序列為與病毒蛋白相互作用起抑制效果的功能序列。結(jié)論:Lnc RNA GAS5具有顯著的抗HCV的效果,其作用機(jī)制為通過與HCV NS3蛋白的相互作用,干擾NS3蛋白酶的活性,進(jìn)而阻礙病毒的復(fù)制。GAS5在感染中高表達(dá)可能涉及宿主對(duì)病毒感染的抵御作用,為闡明抗病毒機(jī)制、發(fā)展抗病毒藥物等提供助力。第三部分間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體抗HCV感染的作用及機(jī)制研究方法:利用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(u MSC)的上清及Transwell共培養(yǎng)檢測(cè)u MSC旁分泌在HCV感染中的作用。進(jìn)一步分離獲得上清中的外泌體(u MSC-Exo),明確外泌體在病毒感染中的效果。利用動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)明確u MSC-Exo在病毒感染生命周期中抑制的階段。通過單周期HCV假病毒顆粒,排除u MSC-Exo對(duì)病毒入侵的影響。應(yīng)用電穿技術(shù)將病毒RNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞或HCV復(fù)制子細(xì)胞,評(píng)估u MSC-Exo對(duì)HCV復(fù)制的影響。檢測(cè)轉(zhuǎn)染病毒RNA的細(xì)胞內(nèi)外病毒顆粒的再感染性,明確u MSC-Exo對(duì)病毒組裝、釋放的影響。通過蛋白酶K實(shí)驗(yàn)確定外泌體中何種成分具有抑制HCV感染的活性。對(duì)u MSC-Exo中的小RNA進(jìn)行測(cè)序,選取在其中高表達(dá)的前15個(gè)micro RNA(mi RNA),并利用功能性實(shí)驗(yàn)包括過表達(dá)或干擾技術(shù),明確具有抑制HCV感染功能的mi RNA。將鑒定的mi RNA的抑制劑轉(zhuǎn)染u MSC,檢測(cè)其分泌的u MSC-Exo的抗病毒活性。將u MSC-Exo與臨床上的抗HCV藥物聯(lián)合運(yùn)用,并評(píng)估其抑制效果。結(jié)果:u MSC可通過旁分泌抑制靶細(xì)胞中HCV的感染,且u MSC-Exo是這個(gè)過程中主要起效的活性物質(zhì)。u MSC-Exo能有效進(jìn)入Huh7細(xì)胞中,降低感染細(xì)胞的病毒RNA水平和病毒蛋白的表達(dá)。u MSC-Exo對(duì)HCV的入侵并無影響,但是能顯著抑制病毒的復(fù)制。蛋白酶K實(shí)驗(yàn)明確u MSC-Exo起效的分子為其內(nèi)的RNA成分。u MSC-Exo的小RNA測(cè)序中高表達(dá)的前15個(gè)mi RNA中,有9個(gè)mi RNA在u MSC-Exo處理的靶細(xì)胞中高表達(dá),而功能性實(shí)驗(yàn)提示其中4個(gè)mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)在u MSC-Exo的抗病毒效果中發(fā)揮主要作用。將這4個(gè)mi RNA的抑制劑轉(zhuǎn)染u MSC后,其分泌的u MSC-Exo的抗病毒效果明顯下降。將u MSC-Exo與IFN或VX-950聯(lián)合運(yùn)用能協(xié)同抑制HCV的感染。結(jié)論:u MSC-Exo具有顯著的抗HCV的活性,其作用機(jī)制為通過外泌體包裹的具有抗HCV感染作用的mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)抑制病毒的復(fù)制,進(jìn)而阻斷病毒感染。此工作為解析HCV感染的分子機(jī)制及抗病毒治療的發(fā)展提供了新的思路和可能性�！拘〗Y(jié)】本研究通過高通量篩選天然化合物庫(kù),發(fā)現(xiàn)了具有抗HCV活性的SZA和TGN,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩者分別通過靶向病毒膜融合及入侵關(guān)鍵受體CD81抑制HCV的入侵。通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在HCV感染后上調(diào)的lnc RNA GAS5,分析其作用機(jī)制為通過與病毒NS3蛋白相互作用,干擾其活性,從而阻礙病毒的復(fù)制。首次發(fā)現(xiàn)u MSC-Exo具有抑制HCV感染的作用,它起效的方式是傳遞u MSC-Exo包裹的特有的具有抗HCV活性的mi RNA至感染的靶細(xì)胞。以上這些研究成果發(fā)現(xiàn)并鑒定了外源性及內(nèi)源性HCV抑制性分子,為闡明HCV感染的分子機(jī)制及抗病毒治療的發(fā)展提供了助力。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 病毒入侵 天然化合物 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 間充質(zhì)干細(xì)胞 外泌體 抗病毒治療
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.63
【目錄】：

• 摘要5-10
• Abstract10-16
• 縮略詞表16-18
• 第一部分 抗HCV活性天然化合物的篩選及機(jī)制研究18-45
• 一、前言18-19
• 二、材料19-23
• 三、主要方法23-30
• 四、主要結(jié)果30-43
• 五、討論43-45
• 第二部分 抗HCV長(zhǎng)鏈非編碼RNA的高通量篩選及機(jī)制研究45-62
• 一、前言45-46
• 二、材料46
• 三、主要方法46-49
• 四、主要結(jié)果49-60
• 五、討論60-62
• 第三部分 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體抗HCV感染的作用及機(jī)制研究62-87
• 一、前言62-63
• 二、材料63
• 三、主要方法63-69
• 四、主要結(jié)果69-84
• 五、討論84-87
• 文獻(xiàn)綜述87-98
• 參考文獻(xiàn)98-116
• 在讀期間論文發(fā)表和科研工作情況說明116-118
• 致謝118

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王瑩;煙萆脈帶花葉病毒非翻譯區(qū)順式作用元件的解析及馬鈴薯X病毒超表達(dá)及沉默載體的構(gòu)建[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 何天良;深海熱液口微生物—病毒互作及其次生代謝產(chǎn)物抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的研究[D];浙江大學(xué);2015年

3 錢汐晶;丙型肝炎病毒感染的抑制性分子篩選及作用機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

4 楊彬;RIG-1與幾種病毒相互作用的分子機(jī)理研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 周艷;豬繁殖與呼吸綜合征病毒RdRp的功能解析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

6 寇曉霞;水體和貝類中食源性病毒分子檢測(cè)研究及污染調(diào)查[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（武漢病毒研究所）;2007年

7 馮瑩柱;高通量藥物篩選病毒芯片的研制[D];重慶大學(xué);2013年

8 周密;柯薩奇B4病毒致小鼠胰腺病變及其全基因組序列的研究[D];吉林大學(xué);2008年

9 胡國(guó)君;熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫除梨病毒研究及熱處理植株中病毒siRNAs鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 鄒小輝;5型和41型人腺病毒E1B55K與E4orf6蛋白相互作用研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王杰;量子點(diǎn)標(biāo)記與有機(jī)熒光試劑標(biāo)記對(duì)病毒活性影響的比較[D];西南大學(xué);2015年

2 劉永相;東北虎源消化道病毒宏基因組學(xué)分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 鄭亞洲;獼猴桃病毒種類鑒定及分子特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 杜拉耶（ASSANE HAMIDOU ABDOULAYE）;稻絲核菌菌株40-1中兩個(gè)新型病毒基因組的分子特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 潘玉寧;發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）感染中宿主相關(guān)miRNA表達(dá)譜研究[D];南京大學(xué);2014年

6 姚明杰;丹參酮IIA磺酸鈉抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）活性及其分子機(jī)制研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 鄭言;蜜蜂殘翼病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 黃晶晶;減蛋綜合征病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞途徑的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

9 張璐;坦布蘇病毒對(duì)雛鵝的致病性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 李光東;鴨坦布蘇病毒對(duì)1周齡雛鴨的致病性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：732925