發(fā)布時間：2017-08-24 20:16

  本文關鍵詞：丙型肝炎病毒感染的抑制性分子篩選及作用機制研究

  更多相關文章： 丙型肝炎病毒 病毒入侵 天然化合物 長鏈非編碼RNA 間充質(zhì)干細胞 外泌體 抗病毒治療

【摘要】：【研究背景與目的】丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球重要的公共衛(wèi)生問題,影響著全世界約3%的人口,每年導致超過35萬的死亡病例。HCV感染慢性化程度非常高,病程進展隱匿,終末期患者常伴有慢性肝疾病的發(fā)生,包括肝脂肪變性、肝纖維化,甚至發(fā)展為肝細胞肝癌。目前,并無有效的預防性或治療性疫苗問世。早期治療HCV感染一般采用聚乙二醇干擾素加利巴韋林,療效在不同基因型中差別較大、治療時限較長、不良反應較多。近幾年,針對HCV生命周期中特定病毒蛋白的靶向性藥物,又稱直接作用的抗病毒藥物(DAA)得到了飛速的發(fā)展,有效提高了治療患者的持續(xù)病毒應答率(SVR)。然而,DAA的使用仍舊受到一些問題的限制,如耐藥突變的產(chǎn)生、藥物附帶的一些不良反應、不可忽視的高昂治療費用等。因此,對HCV感染過程的進一步研究,包括研制針對病毒生命周期不同階段的新型藥物,及解析病毒與宿主相互作用中的關鍵分子等,都將加深我們對HCV感染機制的認識,也為發(fā)展更高效、耐受性更好的抗HCV藥物提供研究基礎與助力。HCV的感染包括病毒顆粒的入侵、病毒基因組的翻譯與復制、成熟病毒顆粒的組裝與釋放這些步驟。目前上市的DAA藥物主要通過抑制病毒非結構蛋白的成熟或酶的活性進而阻斷病毒復制的過程。然而,這些藥物由于靶向高度變異的病毒成分,其基因屏障相對較低,且難以起到預防感染的作用,這也是HCV終末期患者肝移植后的病毒再感染率居高不下的一個原因。HCV入侵是一個高度協(xié)調(diào)的多步驟過程,包括病毒的非特異性結合、與靶細胞入侵相關受體的相互作用、病毒內(nèi)吞入靶細胞及與宿主細胞間的膜融合。這個過程為抗HCV治療提供了許多新的靶點,這些靶點由于多靶向宿主細胞成分,因此具有較高的基因屏障。由于入侵抑制劑干擾的是病毒生命周期最開始的階段,此時病毒基因組并未釋放,因此具有同時預防與治療病毒感染的作用。入侵抑制劑與目前的抗HCV藥物聯(lián)合運用,即病毒生命周期多個階段的靶向聯(lián)合治療,可能成為未來抗HCV治療的一個主要方向。研發(fā)新型的覆蓋多基因型的高效HCV入侵抑制劑十分必要。HCV的感染會引起宿主細胞內(nèi)環(huán)境的改變,多種宿主因子的表達會發(fā)生變化。在這其中,一些分子表達水平的變化會進一步影響病毒的感染過程。增進對這類分子,尤其是具有抑制病毒感染作用分子的認識和研究,將大大促進抗HCV研究的發(fā)展。非編碼RNA(nc RNA)早前被認為在細胞中并無實際功能。近幾年,隨著生物技術的發(fā)展及研究的深入,越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在各種的生理或病理過程中發(fā)揮著重要作用。其中對長度小于200 bp的微小RNA(mi RNA)的研究較多,它的作用方式和機制目前已經(jīng)解析得較為透徹。在HCV感染中,較為熟悉的有mi R-122,它通過與病毒基因組5’UTR區(qū)域的相互作用促進病毒的復制,其抑制劑目前已進入臨床試驗階段。我室之前也有報道m(xù)i R-221通過靶向干擾素通路抑制性分子來增加IFN的抗HCV的活性。然而關于長度大于200 bp長鏈非編碼RNA(lnc RNA)的研究仍處于初步階段,其在病毒感染中的研究更少之又少,在HCV感染中的作用更無報道。因此,研究lnc RNA在HCV感染中的作用將進一步完善病毒與宿主相互作用過程的闡述,也為抗病毒藥物提供新的作用靶點。目前抗HCV治療藥物多為針對某一靶點人工合成的化合物,造價昂貴,并可能在人體中產(chǎn)生一定的不良反應。細胞療法是近期較為流行的治療方法之一,其中又以間充質(zhì)干細胞(MSC)療法最為常見,它可通過旁分泌一定的生物學活性物質(zhì)發(fā)揮作用。外泌體就是實現(xiàn)其旁分泌功能的主要介質(zhì)。研究顯示,外泌體既可在細胞間傳遞傳染性病原體也可以傳輸保護性物質(zhì)抑制病原體感染。已有報道稱HCV感染細胞分泌的外泌體可以傳遞具有感染性的病毒顆粒至其他細胞。然而,并無攜帶具有抗HCV物質(zhì)外泌體的報道。人干細胞來源的外泌體是生理培養(yǎng)下的人干細胞成分,生產(chǎn)成本較低,不良反應也較少,是未來再生醫(yī)學的重要組成部分。因此,研究其在HCV感染過程中的作用具有現(xiàn)實意義。第一部分抗HCV活性天然化合物的篩選及機制研究方法:通過HCV體外感染模型,從數(shù)百種天然藥用植物來源的化合物中,高通量篩選出具有抗HCV活性的來源于保肝中藥五味子的四環(huán)三萜類化合物甘五酸(SZA)和來源于抗炎中藥絡石藤的木脂內(nèi)酯類化合物絡石藤苷元(TGN)。應用不同基因型的單周期HCV假病毒顆粒及原代人肝細胞,初步分析化合物對病毒入侵的影響。繼而通過病毒動力學實驗,精確定位化合物抗HCV的有效靶點。采用密度梯度超速離心法分析化合物對病毒本身脂密度及感染性的影響。利用流式細胞術、免疫印跡及病毒結合活性實驗排除化合物對HCV靶細胞表面入侵相關受體的作用。以Di D介導的膜融合動態(tài)監(jiān)測實驗研究SZA對入侵結合后的膜融合環(huán)節(jié)的作用,利用熒光染料Prodan檢測了SZA對脂質(zhì)膜流動性的影響;通過流式細胞術檢測TGN對結合到細胞表面的病毒E2含量的影響,設計CD81與HCV E2的免疫共沉淀實驗并檢測TGN在其中的作用,利用預測軟件對TGN在CD81上的作用位點進行預測分析。測試SZA和TGN在細胞間病毒傳遞及與臨床上抗HCV藥物聯(lián)合運用的效果。綜合分析SZA和TGN的抗HCV療效、作用靶點及靶向病毒生命周期的抗病毒機制。結果:SZA和TGN細胞毒性較小,可顯著抑制細胞來源的HCV(HCVcc)和HCV假病毒顆粒(HCVpp)感染靶細胞。SZA和TGN在不同型別的HCVpp中的抑制效果一致,并能阻斷HCVpp入侵原代人肝細胞。動力學實驗提示,兩者的作用靶點位于病毒感染早期入侵階段的結合后步驟。SZA和TGN對病毒本身的脂密度和RNA水平的分布,及細胞表面入侵受體表達量和病毒結合活性并無顯著影響。DID介導的膜融合動態(tài)監(jiān)測實驗提示,SZA可能通過破壞病毒與細胞膜融合的過程抑制病毒感染。同時,細胞脂質(zhì)膜的流動性也在SZA的作用下升高。TGN則干擾了HCV E2蛋白與入侵關鍵分子CD81之間的相互作用,且分子預測軟件結果顯示,CD81大胞外環(huán)上的Thr166、Asn184、Lys187或Glu188與TGN形成的氫鍵可能在TGN抑制病毒入侵中發(fā)揮著重要作用。此外,SZA和TGN能顯著抑制細胞間病毒的傳遞,且與干擾素或VX-950聯(lián)合運用后具有協(xié)同抑制病毒感染的效果。結論:天然植物來源的SZA和TGN具有顯著的抗HCV感染的活性。兩者的作用機制為干擾了HCV感染早期的必要步驟即病毒入侵,與目前傳統(tǒng)的DAA的治療靶點不同,可作為HCV感染預防及對現(xiàn)有療法的補充,具有廣闊的應用前景。第二部分抗HCV長鏈非編碼RNA的高通量篩選及機制研究方法:通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在HCV感染前后差異表達的系列Lnc RNA。其中,Lnc RNA GAS5所有轉(zhuǎn)錄體在HCV感染后都呈高表達。通過進一步過表達或下調(diào)該Lnc RNA,發(fā)現(xiàn)GAS5的上調(diào)可以顯著抑制HCV的感染,下調(diào)則促進感染。隨后,應用單周期HCV假病毒顆粒,排除GAS5對病毒入侵的影響。通過轉(zhuǎn)染病毒RNA入靶細胞或利用HCV復制子細胞實驗,檢測GAS5對HCV復制的影響。構建GAS5的不同截短體,通過觀察它們在病毒感染中的作用,明確GAS5的功能序列。使用預測軟件分析可能與GAS5相互作用的蛋白,并從中挑選出與HCV感染尤其是復制相關的蛋白,利用RNA免疫共沉淀(RIP)技術明確兩者之間的相互作用。構建缺失GAS5功能序列的截短體,進一步明確這段序列的抑制作用。綜合評估GAS5抑制HCV感染的靶點和所涉及到的相關機制。結果:GAS5在HCV感染細胞的胞質(zhì)中高表達,并隨感染劑量的上升及感染進展而升高。在Huh7細胞中過表達GAS5,可顯著抑制HCVcc感染靶細胞;下調(diào)GAS5的水平則促進病毒的感染。GAS5對不同基因型HCV假病毒顆粒(HCVpp)入侵靶細胞并無明顯抑制效果。在HCV復制子細胞中過表達GAS5后能顯著降低胞內(nèi)病毒RNA水平,干擾GAS5能提高病毒RNA的表達。GAS5的不同截短體,包括GAS5-251都能抑制病毒的感染。軟件預測GAS5前200 bp與HCV NS3可能存在相互作用。利用RIP技術,將與GAS5相互作用的蛋白拉下,通過Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),過表達GAS5可顯著拉下HCV NS3蛋白,提供了GAS5與病毒NS3蛋白相互作用的依據(jù)。缺失GAS5前200序列的截短體失去原有的抗HCV活性,進一步證實了GAS5前200個序列為與病毒蛋白相互作用起抑制效果的功能序列。結論:Lnc RNA GAS5具有顯著的抗HCV的效果,其作用機制為通過與HCV NS3蛋白的相互作用,干擾NS3蛋白酶的活性,進而阻礙病毒的復制。GAS5在感染中高表達可能涉及宿主對病毒感染的抵御作用,為闡明抗病毒機制、發(fā)展抗病毒藥物等提供助力。第三部分間充質(zhì)干細胞來源的外泌體抗HCV感染的作用及機制研究方法:利用臍帶間充質(zhì)干細胞(u MSC)的上清及Transwell共培養(yǎng)檢測u MSC旁分泌在HCV感染中的作用。進一步分離獲得上清中的外泌體(u MSC-Exo),明確外泌體在病毒感染中的效果。利用動力學實驗明確u MSC-Exo在病毒感染生命周期中抑制的階段。通過單周期HCV假病毒顆粒,排除u MSC-Exo對病毒入侵的影響。應用電穿技術將病毒RNA轉(zhuǎn)染入靶細胞或HCV復制子細胞,評估u MSC-Exo對HCV復制的影響。檢測轉(zhuǎn)染病毒RNA的細胞內(nèi)外病毒顆粒的再感染性,明確u MSC-Exo對病毒組裝、釋放的影響。通過蛋白酶K實驗確定外泌體中何種成分具有抑制HCV感染的活性。對u MSC-Exo中的小RNA進行測序,選取在其中高表達的前15個micro RNA(mi RNA),并利用功能性實驗包括過表達或干擾技術,明確具有抑制HCV感染功能的mi RNA。將鑒定的mi RNA的抑制劑轉(zhuǎn)染u MSC,檢測其分泌的u MSC-Exo的抗病毒活性。將u MSC-Exo與臨床上的抗HCV藥物聯(lián)合運用,并評估其抑制效果。結果:u MSC可通過旁分泌抑制靶細胞中HCV的感染,且u MSC-Exo是這個過程中主要起效的活性物質(zhì)。u MSC-Exo能有效進入Huh7細胞中,降低感染細胞的病毒RNA水平和病毒蛋白的表達。u MSC-Exo對HCV的入侵并無影響,但是能顯著抑制病毒的復制。蛋白酶K實驗明確u MSC-Exo起效的分子為其內(nèi)的RNA成分。u MSC-Exo的小RNA測序中高表達的前15個mi RNA中,有9個mi RNA在u MSC-Exo處理的靶細胞中高表達,而功能性實驗提示其中4個mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)在u MSC-Exo的抗病毒效果中發(fā)揮主要作用。將這4個mi RNA的抑制劑轉(zhuǎn)染u MSC后,其分泌的u MSC-Exo的抗病毒效果明顯下降。將u MSC-Exo與IFN或VX-950聯(lián)合運用能協(xié)同抑制HCV的感染。結論:u MSC-Exo具有顯著的抗HCV的活性,其作用機制為通過外泌體包裹的具有抗HCV感染作用的mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)抑制病毒的復制,進而阻斷病毒感染。此工作為解析HCV感染的分子機制及抗病毒治療的發(fā)展提供了新的思路和可能性�！拘〗Y】本研究通過高通量篩選天然化合物庫,發(fā)現(xiàn)了具有抗HCV活性的SZA和TGN,進一步研究發(fā)現(xiàn)兩者分別通過靶向病毒膜融合及入侵關鍵受體CD81抑制HCV的入侵。通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在HCV感染后上調(diào)的lnc RNA GAS5,分析其作用機制為通過與病毒NS3蛋白相互作用,干擾其活性,從而阻礙病毒的復制。首次發(fā)現(xiàn)u MSC-Exo具有抑制HCV感染的作用,它起效的方式是傳遞u MSC-Exo包裹的特有的具有抗HCV活性的mi RNA至感染的靶細胞。以上這些研究成果發(fā)現(xiàn)并鑒定了外源性及內(nèi)源性HCV抑制性分子,為闡明HCV感染的分子機制及抗病毒治療的發(fā)展提供了助力。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒 病毒入侵 天然化合物 長鏈非編碼RNA 間充質(zhì)干細胞 外泌體 抗病毒治療
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 摘要5-10
• Abstract10-16
• 縮略詞表16-18
• 第一部分 抗HCV活性天然化合物的篩選及機制研究18-45
• 一、前言18-19
• 二、材料19-23
• 三、主要方法23-30
• 四、主要結果30-43
• 五、討論43-45
• 第二部分 抗HCV長鏈非編碼RNA的高通量篩選及機制研究45-62
• 一、前言45-46
• 二、材料46
• 三、主要方法46-49
• 四、主要結果49-60
• 五、討論60-62
• 第三部分 間充質(zhì)干細胞來源的外泌體抗HCV感染的作用及機制研究62-87
• 一、前言62-63
• 二、材料63
• 三、主要方法63-69
• 四、主要結果69-84
• 五、討論84-87
• 文獻綜述87-98
• 參考文獻98-116
• 在讀期間論文發(fā)表和科研工作情況說明116-118
• 致謝118

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1 沈定霞;李夢東;;丙型肝炎病毒基因組變異性的研究進展[J];國外醫(yī)學(流行病學傳染病學分冊);1993年04期

2 聞玉梅;;人與病毒的斗爭是長期的[J];上海教育;2006年Z1期

3 盧文筠;;脊髓灰白質(zhì)炎病毒基因組的一級結構、基因的組織與基因的表達[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1982年04期

4 ;HIV的tat基因[J];中國公共衛(wèi)生學報;1990年02期

5 王勇,劉秀梅;人類食源性病毒病及相關病毒的研究進展[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);1999年04期

6 劉然;韓劍峰;陳水平;于曼;姜濤;鄧永強;秦成峰;秦鄂德;;登革1型病毒廣州06株基因組全長感染性克隆的構建與鑒定[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2008年04期

7 方美玉,林立輝,任瑞文;我國甲病毒的研究進展[J];中華流行病學雜志;2003年11期

8 ;《科學》雜志公布“非典”病毒基因組序列[J];中國醫(yī)學影像技術;2003年06期

9 董麗;;病毒的復制[J];科學之友;2010年05期

10 楊建國;;腎病綜合征出血熱病毒的抗原和基因性質(zhì)[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1986年02期

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1 周婷;曾三杰;文心田;肖馳;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒重慶株的分離鑒定[A];第六屆全國會員代表大學暨第11次學術研討會論文集（上）[C];2005年

2 周婷;曹三杰;文心田;肖馳;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒重慶株的分離鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學術研討會論文集[C];2005年

3 方美玉;任瑞文;劉建偉;;我國甲病毒的研究進展及其預防[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點研討會論文集[C];2009年

4 劉光清;云濤;倪征;;豬生殖與呼吸綜合征病毒的基因組及致病的分子基礎[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆理事會第二次會議暨教學專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

5 楊漢春;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組遺傳變異研究進展[A];中國青年農(nóng)業(yè)科學學術年報[C];2002年

6 劉長龍;孫志;高飛;陸嘉琦;袁世山;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組3′末端保守序列對病毒復制影響的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2009學術年會論文集（下冊）[C];2009年

7 劉長龍;孫志;高飛;陸嘉琦;劉長龍;袁世山;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組3'末端保守序列對病毒復制影響的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第四次豬病防控學術研討會論文集[C];2010年

8 劉長龍;孫志;高飛;陸嘉琦;袁世山;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組3′末端保守序列對病毒復制影響的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

9 劉志剛;姚蓉;郭學波;劉冰心;晁行周;鄒忠;金梅林;;鴨坦布蘇病毒最新研究進展[A];第五屆（2013）中國水禽發(fā)展大會會刊[C];2013年

10 曹貞貞;張大丙;;坦布蘇病毒基因組結構分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 編譯 姚春霞;能殺死癌細胞且對健康細胞無害的病毒[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2009年

2 記者 鄭靈巧;我國西北地區(qū)發(fā)現(xiàn)塔希納病毒[N];健康報;2010年

3 曉艷;誘導突變殺滅病毒[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

4 記者毛磊;美公布非典病毒基因組序列[N];人民日報;2003年

5 記者 盧蘇燕;法國發(fā)現(xiàn)特大病毒可能侵害人體肺部[N];新華每日電訊;2003年

6 記者 毛磊;非典病毒基因組序列[N];新華每日電訊;2003年

7 楊駿;巨病毒不是病毒[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

8 楊駿;巨病毒可能是“第四類微生物”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

9 記者 李斌;非典病毒全基因組芯片問世[N];新華每日電訊;2003年

10 梓信;法國發(fā)現(xiàn)最大體積病毒[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

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1 王瑩;煙萆脈帶花葉病毒非翻譯區(qū)順式作用元件的解析及馬鈴薯X病毒超表達及沉默載體的構建[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2014年

2 何天良;深海熱液口微生物—病毒互作及其次生代謝產(chǎn)物抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的研究[D];浙江大學;2015年

3 錢汐晶;丙型肝炎病毒感染的抑制性分子篩選及作用機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

4 楊彬;RIG-1與幾種病毒相互作用的分子機理研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2012年

5 周艷;豬繁殖與呼吸綜合征病毒RdRp的功能解析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

6 寇曉霞;水體和貝類中食源性病毒分子檢測研究及污染調(diào)查[D];中國科學院研究生院（武漢病毒研究所）;2007年

7 馮瑩柱;高通量藥物篩選病毒芯片的研制[D];重慶大學;2013年

8 周密;柯薩奇B4病毒致小鼠胰腺病變及其全基因組序列的研究[D];吉林大學;2008年

9 胡國君;熱處理結合化學處理脫除梨病毒研究及熱處理植株中病毒siRNAs鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2012年

10 鄒小輝;5型和41型人腺病毒E1B55K與E4orf6蛋白相互作用研究[D];中國疾病預防控制中心;2013年

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1 王杰;量子點標記與有機熒光試劑標記對病毒活性影響的比較[D];西南大學;2015年

2 劉永相;東北虎源消化道病毒宏基因組學分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

3 鄭亞洲;獼猴桃病毒種類鑒定及分子特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

4 杜拉耶（ASSANE HAMIDOU ABDOULAYE）;稻絲核菌菌株40-1中兩個新型病毒基因組的分子特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

5 潘玉寧;發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）感染中宿主相關miRNA表達譜研究[D];南京大學;2014年

6 姚明杰;丹參酮IIA磺酸鈉抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）活性及其分子機制研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2014年

7 鄭言;蜜蜂殘翼病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 黃晶晶;減蛋綜合征病毒進入宿主細胞途徑的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

9 張璐;坦布蘇病毒對雛鵝的致病性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2015年

10 李光東;鴨坦布蘇病毒對1周齡雛鴨的致病性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2014年

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