本文關(guān)鍵詞：人工改造的EGS對(duì)乙型肝炎病毒基因表達(dá)及復(fù)制抑制效果的研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)屬嗜肝DNA病毒,它是目前肝臟疾病,如病毒性肝炎、肝硬化的主要原因。目前全球約有4億人慢性感染乙型肝炎病毒。HBV能夠在肝細(xì)胞中進(jìn)行原發(fā)性感染和慢性感染,目前針對(duì)慢性乙肝肝炎的抗病毒治療主要采用重組干擾素和以拉米夫定和阿德福韋為代表的核苷類似物。但是迄今為止,由于治療藥物的副作用以及抗藥毒株的產(chǎn)生,還沒(méi)有藥物能夠根本性治療HBV的慢性感染。因此,開發(fā)新型抗乙肝病毒慢性感染藥物仍然是目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。核酶P是廣泛存在于人體各種組織中的一種核酶,其主要功能是催化細(xì)胞內(nèi)tRNA前體的成熟。EGS RNA可以與靶標(biāo)mRNA部分互補(bǔ)配對(duì)形成類似tRNA前體的結(jié)構(gòu),并且能夠招募細(xì)胞內(nèi)的核酶P高效的降解靶標(biāo)mRNA。在本研究中,通過(guò)DMS轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),在HBV的S mRNA, pre-S/L mRNA, pgRNA的重疊區(qū)域篩選出了可與EGS結(jié)合的靶位點(diǎn),并根據(jù)此前的研究,設(shè)計(jì)出EGS突變體S-C386。本研究通過(guò)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)得到了EGS與靶標(biāo)mRNA結(jié)合的最佳濃度,體外剪切實(shí)驗(yàn)表明,相較于根據(jù)天然ptRNA序列設(shè)計(jì)的EGS S-SER,改造后的EGS突變體S-C386招募核酶P分解靶標(biāo)mRNA HepG2勺能力提升了50倍。減毒的沙門氏菌作為一種有效的口服基因藥物載體,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于DNA疫苗和抗腫瘤藥物的研發(fā)中。肝臟是沙門氏菌系統(tǒng)性感染后的主要聚集組織之一,并且沙門氏菌能夠入侵并感染肝細(xì)胞。因此以減毒的沙門氏菌為載體,能夠有效的幫助EGS在肝細(xì)胞中靶向性表達(dá),提高EGS對(duì)HBV復(fù)制表達(dá)的抑制效率。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明以沙門氏菌為載體的基因給藥途徑能夠在HepG2細(xì)胞中高效表達(dá)各種EGS,并且沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。以減毒沙門氏菌為載體在HepG2.215細(xì)胞中分別表達(dá)EGS S-C386與EGS S-SER,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中HBV RNA和蛋白的表達(dá)水平分別下降了97%和75%,帶有HBV基因組DNA分別減少了6000倍和130倍。本研究表明,通過(guò)人工改造可以極大的提高EGS突變體抑制HBV基因表達(dá)和DNA復(fù)制的能力；此外也證明了通過(guò)沙門氏菌介導(dǎo)表達(dá)高效EGS突變體的基因療法在抗HBV治療方面具有很高的可行性。TP蛋白是HBV多聚酶的重要組成部分,能夠行使引物的作用,啟動(dòng)病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng),我們篩選出了14個(gè)與TP蛋白相互作用的宿主蛋白。通過(guò)研究TP蛋白與這些宿主蛋白的相互作用,有助于了解HBV基因組復(fù)制的機(jī)制,為抗HBV治療提供新的方向。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 外部引導(dǎo)序列 核酶P 沙門氏菌
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 縮略詞表13-14
• 第一章 引言14-30
• 1.1 乙型肝炎病毒概述14-21
• 1.1.1 乙型肝炎病毒簡(jiǎn)介14-17
• 1.1.2 乙型肝炎病毒的感染復(fù)制周期17-19
• 1.1.3 HBV相關(guān)的免疫應(yīng)答19-20
• 1.1.4 HBV耐藥性及停藥反彈機(jī)制20
• 1.1.5 HBV治療藥物研究進(jìn)展20-21
• 1.2 外部引導(dǎo)序列的概述21-24
• 1.2.1 核酶的簡(jiǎn)介21-22
• 1.2.2 影響核酶P催化的因素22-23
• 1.2.3 EGS的發(fā)現(xiàn)23
• 1.2.4 EGS在研究中的應(yīng)用23-24
• 1.3 沙門氏菌概述24-30
• 1.3.1 沙門氏菌簡(jiǎn)介24
• 1.3.2 沙口氏菌的入侵機(jī)制24-25
• 1.3.3 減毒活疫苗載體研究進(jìn)展25-26
• 1.3.4 沙門氏茵減毒株的構(gòu)建26-27
• 1.3.5 減毒沙門氏菌載體的優(yōu)點(diǎn)27-28
• 1.3.6 以減毒沙門氏茵為載體的活疫苗應(yīng)用研究28-30
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法30-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備30-31
• 2.2 基本實(shí)驗(yàn)材料與試劑31-32
• 2.3 常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)32-40
• 2.3.1 大腸桿菌DH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備32-33
• 2.3.2 大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)33-34
• 2.3.3 SDS堿裂解法粗提質(zhì)粒34-35
• 2.3.5 Northern Blot實(shí)驗(yàn)35-40
• 2.4 酵母雙雜交系列實(shí)驗(yàn)40-45
• 2.4.1 文庫(kù)信息40
• 2.4.2 試劑與培養(yǎng)基準(zhǔn)備40-42
• 2.4.3 文庫(kù)滴定42
• 2.4.4 Bait菌株的構(gòu)建42-43
• 2.4.5 酵母雙雜交篩選文庫(kù)43-44
• 2.4.6 X-gal顯色實(shí)驗(yàn)44
• 2.4.7 酵母質(zhì)粒提取44-45
• 2.5 細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)45-48
• 2.5.1 細(xì)胞的培養(yǎng)45-46
• 2.5.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)基及試劑45
• 2.5.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇（以Hela細(xì)胞為例）45-46
• 2.5.1.3 細(xì)胞傳代46
• 2.5.1.4 細(xì)胞凍存46
• 2.5.2 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞46-47
• 2.5.3 使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分選47-48
• 2.6 核酶P體外剪切HBV S RNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)48-53
• 2.6.1 硫酸二甲酯轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)48
• 2.6.2 核酶P的提取與鑒定48-50
• 2.6.3 基因的克隆與體外轉(zhuǎn)錄(以HBV S為例)50-52
• 2.6.4 EGS與RNA底物結(jié)合實(shí)驗(yàn)52
• 2.6.5 EGS介導(dǎo)核酶P剪切s38RNA的體外實(shí)驗(yàn)52-53
• 2.7 沙門氏菌侵染HepG2.215細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)53-56
• 2.7.1 體外測(cè)定沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線53
• 2.7.2 以沙門氏菌為載體在人體細(xì)胞中表達(dá)EGS RNA53
• 2.7.3 沙門氏菌的入侵對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè)53-54
• 2.7.4 ELESA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBV E抗原、表面抗原濃度54
• 2.7.5 使用qPCR分析HBV capsid-associated DNA水平54-56
• 第三章 人工改造的EGS對(duì)HBV基因表達(dá)和復(fù)制抑制作用的研究56-76
• 3.1 研究背景56-57
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-69
• 3.2.1 分析S mRNA可被EGS結(jié)合的位點(diǎn)57-58
• 3.2.2 EGS介導(dǎo)核酶P對(duì)HBV的S RNA進(jìn)行剪切的體外實(shí)驗(yàn)58-62
• 3.2.3 以沙門氏菌為載體在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)EGS62-65
• 3.2.4 以沙門氏菌為載體介導(dǎo)表達(dá)EGS,在細(xì)胞中抑制HBV的感染和復(fù)制65-69
• 3.3 討論與小結(jié)69-71
• 3.4 研究展望——人工改造的EGS抗HBV的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案71-76
• 3.4.1 研究背景71-72
• 3.4.2 技術(shù)路線72-73
• 3.4.3 研究方案73-76
• 第四章 HBV TP蛋白與肝細(xì)胞表達(dá)蛋白相互作用的研究76-85
• 4.1 背景介紹76-78
• 4.1.1 TP蛋白的簡(jiǎn)介76-77
• 4.1.2 酵母雙雜交原理77-78
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果78-83
• 4.2.1 文庫(kù)滴度測(cè)定與轉(zhuǎn)化率測(cè)定結(jié)果78-79
• 4.2.2 酵母質(zhì)粒的提取與鑒定79-81
• 4.2.3 序列測(cè)定與分析81-83
• 4.3 分析與討論83-85
• 參考文獻(xiàn)85-102
• 攻讀博士期間的學(xué)術(shù)成果102-104
• 致謝104

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本文編號(hào)：715004