本文關(guān)鍵詞：一種檢測乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)nt1758-1777缺失突變新方法的建立

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【摘要】：目的建立一種新的單管巢式實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法用于快速靈敏地篩檢臨床乙型肝炎病毒(HBV)樣本核心啟動(dòng)子區(qū)nt1758-1777片段缺失突變。方法通過比對分析Gen Bank收錄的HBV基因序列,設(shè)計(jì)通用巢式PCR引物,建立優(yōu)化方法體系;對340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物直接測序,并隨機(jī)選擇50例樣本進(jìn)行克隆測序,分析nt1758-1777缺失突變檢出率。野生型和缺失型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒來自于單克隆測序樣本,并對兩種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及克隆檢測樣本進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,獲得熔解曲線及熔解溫度,得到熔解曲線的陽性標(biāo)準(zhǔn)。用新建立的方法對340份樣本進(jìn)行檢測,并用焦磷酸測序加以驗(yàn)證。結(jié)果直接測序法檢出16例(4.7%)陽性樣本。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及克隆檢測樣本中缺失序列比例≥15%的樣品,其熔解溫度(Tm)≥88.3℃,遂將≥88.3℃作為新方法的陽性標(biāo)準(zhǔn)。用新方法檢出47例(13.8%)陽性樣本,其中用焦磷酸測序驗(yàn)證缺失突變比例≥1.0%的樣本38例,1.0%的樣本9例;15份陰性樣本缺失突變比例均1.0%。用焦磷酸測序驗(yàn)證缺失突變比例1.0%作為陽性閾值,新方法對nt1758-1777缺失檢測的陽性符合率為80.9%,陰性符合率為100%,兩種方法的一致性Kappa值為0.671。結(jié)論與直接測序法相比,新方法可顯著提高nt1758-1777缺失檢出率,結(jié)合焦磷酸測序證實(shí),可有效提高檢測的準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)性。該方法對建立HBV其他缺失突變的檢測方法也可提供借鑒。
【作者單位】： 北京大學(xué)解放軍302醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院臨床研究管理中心;解放軍302醫(yī)院臨床研究管理中心;
【關(guān)鍵詞】： 乙型肝炎病毒 核心啟動(dòng)子 基因缺失 熔解曲線 焦磷酸測序
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81373136,81271847)~~
【分類號(hào)】：R512.62;R440
【正文快照】： 乙型肝炎慢性化與重癥化的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,其中乙型肝炎病毒(HBV)基因突變導(dǎo)致的病毒生物學(xué)特性改變可能是重要因素之一[1-3]。HBV核心啟動(dòng)子(core promoter,CP)區(qū)是病毒的關(guān)鍵序列,可調(diào)控HBV前基因RNA(pg RNA)和Pre C/Cm RNA的表達(dá)。此外,HBV CP區(qū)與HBV X基因讀碼框3'端重

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：680665