發(fā)布時間：2017-08-09 22:29

  本文關(guān)鍵詞：A20在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎中的作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 幽門螺桿菌 A20 miR-29a-3p NF-κB信號通路

【摘要】：目的:本研究旨在檢測H.pylori感染組織及細(xì)胞中A20及mi R-29a-3p的表達(dá)差異,明確在H.pylori感染中H.pylori、mi R-29a-3p、A20三者間的作用關(guān)系,探索A20在H.pylori感染相關(guān)性胃炎發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,有望為臨床H.pylori感染相關(guān)性胃炎的分子診斷及靶向治療提供新的依據(jù)和思路。方法:采用IHC及qRT-PCR的方法檢測H.pylori感染胃黏膜組織中A20、mi R-29a-3p的表達(dá),Western blot及q RT-PCR分析H.pylori感染細(xì)胞模型中A20、mi R-29a-3p的表達(dá)。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測mi R-29a-3p的靶基因,通過Luciferase和Western blot驗(yàn)證mi R-29a-3p的靶基因。mi R-29a-3p mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再感染H.pylori,Western blot分析H.pylori、A20、mi R-29a-3p三者間的作用關(guān)系。采用基因干擾、過表達(dá)技術(shù)分別沉默和過表達(dá)A20,Western blot檢測phosphorylated NF-κB p65及NF-κB p65的表達(dá),免疫熒光分析NF-κB p65核轉(zhuǎn)位,q RT-PCR和ELISA分析NF-κB下游炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)。同時將基因干擾和H.pylori感染相結(jié)合,初步探索A20在H.pylori感染相關(guān)性胃炎中的作用機(jī)制。結(jié)果:相對于H.pylori感染陰性的正常胃黏膜或輕度胃炎組織,A20在H.pylori感染陽性的胃炎或潰瘍組織中表達(dá)顯著降低,體外H.pylori感染細(xì)胞模型中顯示了一致的結(jié)果,并且A20表達(dá)降低具有H.pylori感染時間和濃度依賴性。而mi R-29a-3p在H.pylori感染陽性的胃炎或潰瘍組織中表達(dá)上調(diào),在體外H.pylori感染細(xì)胞模型中mi R-29a-3p表達(dá)也增加且具有H.pylori感染濃度依賴性。A20被預(yù)測驗(yàn)證為mi R-29a-3p的靶基因,在H.pylori感染中H.pylori通過上調(diào)mi R-29a-3p表達(dá)進(jìn)而使A20表達(dá)水平降低。過表達(dá)A20能增強(qiáng)phosphorylated NF-κB p65的表達(dá)及NF-κB p65核轉(zhuǎn)位,同時增加NF-κB下游炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá),而沉默A20表達(dá)后,則能相應(yīng)地抑制NF-κB p65的活化及其下游炎癥因子的表達(dá)。相對于H.pylori感染組,IL-6和IL-8在A20沉默后再感染H.pylori組中的表達(dá)水平降低,表明沉默A20能抑制H.pylori感染所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。結(jié)論:A20在H.pylori感染組織及細(xì)胞中表達(dá)降低,而mi R-29a-3p在H.pylori感染組織及細(xì)胞中表達(dá)增加,A20是mi R-29a-3p的直接靶基因,在H.pylori感染中H.pylori通過上調(diào)mi R-29a-3p表達(dá)進(jìn)而使A20表達(dá)水平降低。A20表達(dá)降低能抑制NF-κB活化及其下游炎癥因子的表達(dá),提示A20表達(dá)下調(diào)可能在H.pylori感染中起到保護(hù)機(jī)體免受損傷的作用。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 A20 miR-29a-3p NF-κB信號通路
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R573.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 英文縮略詞中英注釋表13-15
• 第一章 緒論15-23
• 1.1 H.pylori簡述15
• 1.2 參與H.pylori相關(guān)性胃炎發(fā)生的主要毒力因子15-17
• 1.3 參與H.pylori相關(guān)性胃炎發(fā)生的差異表達(dá)基因17-19
• 1.3.1 異常表達(dá)的miRNAs與H.pylori相關(guān)性胃炎發(fā)生的關(guān)系17
• 1.3.2 異常表達(dá)的Lnc RNAs與H.pylori相關(guān)性胃炎發(fā)生的關(guān)系17-19
• 1.4 炎癥相關(guān)蛋白A20的研究19-23
• 1.4.1 A20的生物學(xué)特性19
• 1.4.2 A20在組織中的表達(dá)19-20
• 1.4.3 A20與疾病的關(guān)系20-21
• 1.4.4 A20與病原微生物21-23
• 第二章 研究目的、方法、技術(shù)路線及意義23-26
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法23-24
• 2.3 技術(shù)路線24-25
• 2.3.1 H.pylori感染組織及細(xì)胞中A20、miR-29a-3p的表達(dá)分析24
• 2.3.2 H.pylori、miR-29a-3p、A20三者間調(diào)控關(guān)系的研究24-25
• 2.3.3 A20通過NF-κB參與H.pylori誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)25
• 2.4 研究意義25-26
• 第三章 H.pylori感染組織及細(xì)胞中A20、mi R-29a-3p表達(dá)分析26-41
• 3.1 材料26-30
• 3.1.1 組織標(biāo)本采集26-27
• 3.1.2 細(xì)胞和菌株27
• 3.1.3 主要試劑27-28
• 3.1.4 主要溶液配制28-29
• 3.1.5 主要儀器及耗材29-30
• 3.2 方法30-34
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 3.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)31
• 3.2.3 細(xì)胞與H.pylori 26695共培養(yǎng)31
• 3.2.4 免疫組織化學(xué)31-32
• 3.2.5 Western blot32
• 3.2.6 組織和細(xì)胞總RNA提取32-33
• 3.2.7 miRNA逆轉(zhuǎn)錄33
• 3.2.8 miRNA定量33-34
• 3.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理34
• 3.3 結(jié)果34-38
• 3.3.1 A20在H.pylori感染陽性胃黏膜組織中的表達(dá)34-35
• 3.3.2 H.pylori感染細(xì)胞模型中A20蛋白表達(dá)35-36
• 3.3.3 A20在H.pylori不同感染時間及濃度下的表達(dá)分析36
• 3.3.4 細(xì)胞及組織標(biāo)本總RNA完整性及純度檢測36-37
• 3.3.5 H.pylori感染的胃黏膜組織中miR-29a-3p的表達(dá)37-38
• 3.3.6 H.pylori感染細(xì)胞模型中miR-29a-3p的表達(dá)38
• 3.4 討論38-41
• 第四章 H. pylori感染中H. pylori、miR-29a-3p、A20三者間作用關(guān)系驗(yàn)證41-55
• 4.1 材料41-43
• 4.1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒41-42
• 4.1.2 主要試劑42
• 4.1.3 主要溶液配制42-43
• 4.1.4 主要儀器43
• 4.2 方法43-49
• 4.2.1 miR-29a-3p靶基因預(yù)測43
• 4.2.2 寡核苷酸片段設(shè)計43-44
• 4.2.3 互補(bǔ)寡核苷酸退火44
• 4.2.4 空psiCHECK-2 載體雙酶切44-45
• 4.2.5 psiCHECK-2 雙酶切產(chǎn)物膠回收45
• 4.2.6 T-4 連接反應(yīng)45
• 4.2.7 感受態(tài)細(xì)胞制備45-46
• 4.2.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞46
• 4.2.9 重組質(zhì)粒鑒定46
• 4.2.10 質(zhì)粒提取46-47
• 4.2.11 質(zhì)粒與miRNA共轉(zhuǎn)染47-48
• 4.2.12 熒光素酶活性檢測48
• 4.2.13 miRNA（mimics/inhibitors）轉(zhuǎn)染48
• 4.2.14 統(tǒng)計學(xué)處理48-49
• 4.3 結(jié)果49-52
• 4.3.1 miR-29a-3p與A20 mRNA3'UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測49
• 4.3.2 雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建與鑒定49-50
• 4.3.3 miR-29a-3p與A20 mRNA3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的驗(yàn)證50-51
• 4.3.4 miR-29a-3p在轉(zhuǎn)錄后水平抑制A20蛋白表達(dá)的驗(yàn)證51-52
• 4.3.5 在H.pylori感染中H.pylori、miR-29a-3p、A20三者間作用關(guān)系的驗(yàn)證52
• 4.4 討論52-55
• 第五章 初步探索A20在H.pylori誘導(dǎo)的胃相關(guān)性炎癥中的作用機(jī)制55-66
• 5.1 材料55-56
• 5.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒55
• 5.1.2 主要試劑55-56
• 5.1.3 主要儀器及耗材56
• 5.2 方法56-59
• 5.2.1 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染56-57
• 5.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染57
• 5.2.3 mRNA逆轉(zhuǎn)錄57-58
• 5.2.4 熒光定量PCR58-59
• 5.2.5 免疫熒光59
• 5.2.6 ELISA檢測59
• 5.3 結(jié)果59-63
• 5.3.1 A20 siRNA干擾效果驗(yàn)證59-60
• 5.3.2 A20對phosphorylated NF-κB p65及NF-κB p65表達(dá)的影響60-61
• 5.3.3 A20對NF-κB p65核轉(zhuǎn)位影響61
• 5.3.4 A20對NF-κB p65下游炎癥因子IL-6/IL-8 的表達(dá)影響61-62
• 5.3.5 A20對H.pylori感染誘導(dǎo)的IL-6/IL-8 表達(dá)的影響62-63
• 5.4 討論63-66
• 第六章 主要結(jié)論及展望66-67
• 6.1 主要結(jié)論66
• 6.2 主要展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 致謝74

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本文編號：647662