乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染仍舊是中國乃至全球極為重大的公共衛(wèi)生與健康問題,平均每年死于該病毒感染的人口大約有一百萬。目前全世界累計有20億左右的人口感染過或者正在感染HBV,其中有3500萬人屬于慢性乙肝患者,肝臟內病毒的復制與病毒復制所誘導的長期炎癥反應使得這些人群更加容易受到肝硬化,肝癌和肝衰竭等疾病的嚴重威脅。據(jù)悉,全世界超過50%的肝癌都是由HBV感染造成的,其中丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)和HBV共同感染的患者的病情惡化尤為快速和嚴重。盡管有高效的疫苗和一定的治療手段,乙型肝炎的防治工作任重而道遠,現(xiàn)有的防治體系仍面臨著巨大的挑戰(zhàn),同時HDV感染的治療手段也是很缺乏的。因此,對HBV的基礎研究急需進一步深入和加強,其中HBV對細胞早期入侵過程中的分子機制的探索和研究顯得尤為迫切和重要。 在體內HBV只能感染人,黑猩猩和類靈長類小動物樹鼩(Tupaia belangeri chinenesis, Northern Treeshrew)。可以被HBV體外感染的細胞只有少數(shù)幾種,其中原代樹鼩肝細胞(Primary...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第一章 前言
    第一節(jié) HBV概述
        1.1 HBV的發(fā)現(xiàn)過程及其種屬歸類
        1.2 HBV的血清型和基因型
        1.3 HBV的基因組結構及其轉錄調控
    第二節(jié) HBV感染模型及其研究意義
第二章 實驗材料與實驗方法
    第一節(jié) 樹鼩的飼養(yǎng)
    第二節(jié) PTH的分離純化與培養(yǎng)
        2.1 灌注用手術器械等實驗器材的準備
        2.2 灌注母液的配置
        2.3 PTH貼壁培養(yǎng)基配方
        2.4 PTH維持培養(yǎng)基配方
        2.5 用大鼠鼠尾Ⅰ型膠原包被細胞培養(yǎng)皿
        2.6 兩步法PTH灌注流程
        2.7 樹鼩肝星狀細胞的分離和培養(yǎng)
        2.8 細胞凍存與復蘇
        2.9 樹鼩原代成纖維細胞的分離和培養(yǎng)
        2.10 PTH或者Huh7與HSC或者PTF細胞的共同培養(yǎng)
    第三節(jié) HBV,HDV和WMHBV的制備
        3.1 從病人血清中超速離心純化HBV
        3.2 Huh7細胞的培養(yǎng)
        3.3 用脂質體轉染的方法從Huh7細胞中制備HDV
        3.4 用脂質體轉染的方法從Huh7細胞中制備HBV或者WMHBV
        3.5 HDV的濃縮與純化方式介紹
        3.6 確定HDV的濃度
    第四節(jié) 三種病毒對PTH的侵染和侵染標志物的檢測
        4.1 HBV侵染PTH實驗簡介
        4.2 HDV和WMHBV侵染PTH實驗簡介
        4.3 ELISA檢測HBsAg或者HBeAg
        4.4 檢測PTH內病毒RNA的表達
        4.5 用免疫熒光染色研究PTH內病毒蛋白的表達情況
        4.6 用免疫印跡法研究PTH內特定蛋白的表達
第三章 實驗結果與分析討論
    第一節(jié) PTH的分離與培養(yǎng)
        1.1 PTH分離的結果與討論
        1.2 PTH培養(yǎng)的細胞狀態(tài)和功能
        1.3 PTH對三種病毒的感染結果分析
        1.4 PTH體外感染模型的條件優(yōu)化
        1.5 PTH體外感染模型建立的意義
        1.6 HBV,HDV和WMHBV共同功能性受體的發(fā)現(xiàn),確定和意義
    第二節(jié) RTK-PI3K-AKT信號轉導途徑對病毒感染的作用
        2.1 EGFR和HGFR參與了HBV早期入侵的過程
        2.2 磷脂酰肌醇3激酶也參與了HBV早期入侵的過程
        2.3 蛋白激酶B也參與了HBV早期入侵的過程
        2.4 RTK-PI3K-AKT信號轉導途徑參與HBV入侵的機理探討
    第三節(jié) 探索HBV入侵所需的相關蛋白
        3.1 用免疫共沉淀的方法尋找HBV受體的介紹
        3.2 表達純化和修飾餌蛋白
        3.3 紫外光激活的共價交聯(lián)手段的運用
        3.4 運用光激活的共價交聯(lián)手段進行親和純化的經(jīng)驗總結
        3.5 將preS1-mFc表達質粒轉染到PTH后用Fc親和純化
    第四節(jié) 建立人NTCP的轉基因小鼠模型
小結
附錄
    中英文對照表
    59-RBD-his蛋白序列
參考文獻
論文發(fā)表和專利申請
致謝



本文編號：3948407