發(fā)布時(shí)間：2017-04-30 21:13

  本文關(guān)鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化患者IncRNA表達(dá)譜芯片分析及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, lncRNA)是指核苷酸長度大于200個(gè)堿基的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。起初認(rèn)為lncRNA不具備生物學(xué)功能,但是越來越多的研究證實(shí)IncRNA經(jīng)折疊后可以形成特定的空間結(jié)構(gòu),在表觀遺傳層面、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾層面以及翻譯過程中調(diào)控特定基因的表達(dá),在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。已有不少研究證實(shí)了肝癌、胃癌、前列腺癌中1ncRNA存在異常表達(dá)或序列突變,參與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移；并且還可作為腫瘤診斷、分期、預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。IncRNA在免疫細(xì)胞分化、固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中同樣發(fā)揮重要調(diào)控作用。lnc-DC只在人類樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)中特異性表達(dá),通過與轉(zhuǎn)錄因子STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3)結(jié)合,促進(jìn)單核細(xì)胞向DC分化,同時(shí)增強(qiáng)DC活化T細(xì)胞的能力。X染色體上存在許多與機(jī)體免疫功能相關(guān)的基因如腫瘤壞死因子a (Tumor necrosis factor-a, TNF-a)、CD40配體(Cell differentiation ligand, CD40L)、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3 (Forkhead box P3, FOXP3),而長鏈非編碼RNA Xist (X inactive specific transcript, Xist)參與X染色體失活過程,Xist的序列結(jié)構(gòu)或功能的改變可能導(dǎo)致X染色體上免疫相關(guān)基因的表達(dá)異常,這或許可以部分解釋許多自身免疫性疾病中女性易感的現(xiàn)象。原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis, PBC)是一種以肝內(nèi)中、小膽管損傷導(dǎo)致膽汁淤積,同時(shí)患者血清出現(xiàn)疾病特異的抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibody, AMA),并伴有堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Gamma glutamyl transferase, GGT)等生化指標(biāo)升高為主要特征的器官特異性自身免疫性疾病,好發(fā)于中老年女性,近年來隨著自身抗體檢測的普及和應(yīng)用,發(fā)病率在逐年上升。感染、環(huán)境因素、遺傳因素以及表觀遺傳學(xué)因素等均有可能參與PBC的發(fā)病,但具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。對于IncRNA在PBC中的研究目前還相對較少,無論是肝組織還是外周血中。本課題對PBC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中IncRNA表達(dá)譜的研究可以為PBC的發(fā)病機(jī)理提供新的思路,也可以為PBC的臨床診斷、治療提供新的途徑。第一部分：PBC患者IncRNA表達(dá)譜芯片分析及RT-PCR驗(yàn)證本部分研究收集PBC及健康對照組外周抗凝血各30例,分離PBMC,從中各選取4例進(jìn)行IncRNA表達(dá)譜芯片測定,旨在利用芯片篩選出PBC患者PBMC中差異表達(dá)的lncRNA,并用RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。相比健康對照組,PBC組中共發(fā)現(xiàn)749個(gè)異常表達(dá)的lncRNA,其中541個(gè)上調(diào),208個(gè)下調(diào)。230個(gè)異常表達(dá)的mRNA,其中184個(gè)上調(diào),46個(gè)下調(diào)。從差異表達(dá)的lncRNA譜中選取6個(gè)(uc003xrr、 ucOlOnh、pll02447、NR_026777、ENST00000442026、ENST00000431157)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性,結(jié)果這6個(gè)差異的lncRNA在PBC組中的表達(dá)水平與芯片結(jié)果相符合。第二部分：lncRNA表達(dá)譜芯片生物信息學(xué)分析本部分主要通過對第一部分得到的749個(gè)差異lncRNA進(jìn)行C is-/Trans-靶基因的GO (Gene ontology, GO)、Pathway分析,以及構(gòu)建lncRNA與mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖,分析這些異常表達(dá)的lncRNA參與的細(xì)胞功能和信號通路,為進(jìn)一步探究lncRNA在PBC中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ),指明研究方向。結(jié)果Cis/trans靶基因pathway分析提示這些差異表達(dá)的lncRNA作用的靶基因主要是與細(xì)胞凋亡及代謝途徑相關(guān)。NR4A核受體亞家族廣泛參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如MAKP、NF-KB、 PI3K/JNK、Wnt等,調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、脂質(zhì)代謝、血管形成以及DNA損傷修復(fù)等多種細(xì)胞生物學(xué)過程�？v觀芯片中各基因的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),其成員之一NR4A3基因的表達(dá)水平下調(diào)0.22倍,P值為0.0082。綜合分析芯片上各位點(diǎn)的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)NR4A3基因下游2萬bp左右的位置處lncRNALOC441461的表達(dá)水平與其相反,上調(diào)2.56倍,P值為0.0015。綜合三個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)庫的結(jié)果確定LOC446C61為非編碼RNA。在CatRapid網(wǎng)站在線預(yù)測LOC441461與PRC2復(fù)合物結(jié)合的可能性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LOC441461的核苷酸序列第439-554核苷酸位置處存在PRC2復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn),其中451-552位置處的辨識度高達(dá)94%,預(yù)示它們之間極有可能發(fā)生相互作用。因此,我們猜想PBC患者中LOC441461或許通過招募PRC2復(fù)合物,使NR4A3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化,進(jìn)而下調(diào)NR4A3基因的表達(dá)水平,觸發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng),促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。第三部分：linc-pbc靶點(diǎn)驗(yàn)證及功能探究本部分我們檢測了linc-pbc和NR4A3在PBC組、疾病對照組和健康對照組中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在PBC組中這兩者的表達(dá)水平與芯片結(jié)果相符,P0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)患者中l(wèi)inc-pbc及NR4A3的表達(dá)模式與PBC類似,而乙肝肝硬化(Hepatitis B virus,HBV)患者中這二者的表達(dá)水平與對照組無顯著性差異。設(shè)計(jì)siR NA對linc-pbc進(jìn)行干擾,觀察NR4A3、FOXP3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平的是否有變化。同時(shí)檢測轉(zhuǎn)染siRNA后PBMC的凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染針對linc-pbc的siRNA后,PBMC中l(wèi)inc-pbc的水平下降,而NR4A3的mRNA表達(dá)水平及蛋白質(zhì)水平均上調(diào),FOXP3的水平也上調(diào),這說明line-pbc可能確實(shí)可以通過與PRC2復(fù)合物結(jié)合,抑制NR4A3的表達(dá)；而NR4A3表達(dá)水平的降低將導(dǎo)致其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的活性降低,進(jìn)一步引起下游靶基因FOXP3的表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致循環(huán)外周血液及肝臟組織局部具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞減少,打破機(jī)體免疫耐受平衡狀態(tài),從而誘發(fā)疾病。但另一方面,轉(zhuǎn)染siRNA后,細(xì)胞凋亡水平與陰性對照組并無明顯差異,可能是由于轉(zhuǎn)染的PBMC是從健康人中分離的,而這些健康人的細(xì)胞可能存在一定的損傷修復(fù)機(jī)制,單獨(dú)干擾line-pbc雖然可以使NR4A3的表達(dá)上升,但可能尚不足以引起明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。又或者,NR4A3僅僅促進(jìn)自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的凋亡。結(jié)論P(yáng)BC患者PBMC中,相對于健康對照組,共發(fā)現(xiàn)749個(gè)異常表達(dá)的lncRNA,其中541個(gè)上調(diào),208個(gè)下調(diào)。230個(gè)異常表達(dá)的mRNA,其中184個(gè)上調(diào),46個(gè)下調(diào)。NR4A3基因的表達(dá)水平下調(diào)0.22倍,P值為0.0082。在NR4A3基因下游的lncRNA LOC441461的表達(dá)水平與其相反,上調(diào)2.56倍,P值為0.0015。LOC441461或許通過招募PRC2復(fù)合物,使NR4A3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化,從而下調(diào)NR4A3基因的表達(dá)水平,而下調(diào)的NR4A3調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的活性降低,使得下游的靶基因FOXP3的表達(dá)下降,進(jìn)而導(dǎo)致外周血及肝組織局部具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞數(shù)量減少,打破機(jī)體免疫耐受平衡狀態(tài),促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：長鏈非編碼RNA 原發(fā)性膽汁性肝硬化 NR4A3 LOC441461 PRC2復(fù)合物
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2;R440
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 中英文縮略詞表11-13
• 前言13-16
• 第一部分 PBC患者lncRNA表達(dá)譜芯片分析及RT-PCR驗(yàn)證16-29
• 一、材料與方法16-21
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
• 三、討論26-29
• 第二部分 lncRNA表達(dá)譜芯片生物信息學(xué)分析29-36
• 一、材料與方法30-31
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-34
• 三、討論34-36
• 第三部分 linc-pbc靶點(diǎn)驗(yàn)證及功能探究36-46
• 一、材料與方法36-41
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 三、討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 綜述51-57
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 在讀期間發(fā)表論文57-58
• 致謝58-59

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：337624