本文關(guān)鍵詞：PKCδ激活對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪變性的調(diào)控作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的： 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在近幾十年已經(jīng)成為常見的公共健康問題。NAFLD包含了從單純性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的臨床疾病狀態(tài)，能發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。目前廣泛接受的理論是“二次打擊”學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為，以胰島素抵抗為首的“一次打擊”是引起肝細(xì)胞脂肪變性的主要原因，在此基礎(chǔ)上，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、線粒體功能障礙為標(biāo)志的“二次打擊”導(dǎo)致了單純性脂肪肝向NASH的演進(jìn)。 ERS在NASH肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，是目前的研究熱點(diǎn)，但機(jī)制不明。結(jié)合免疫球蛋白Bip,又稱GRP78或HspA5,是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶,被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白之一。剪切型X盒結(jié)合蛋白XBP-1s(spliced X-box bindingprotein1)不僅可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)元件(endoplasmic reticulum stress responseelement, ERSE)結(jié)合誘導(dǎo)Bip、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)基因的轉(zhuǎn)錄活性，而且能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強(qiáng)因子-α甘露糖苷酶樣蛋白(ER degradation-enhancing-mannosidase-like protein，EDEM)基因的轉(zhuǎn)錄，因此XBP-1s表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的另一標(biāo)志。 蛋白激酶C(protein kinase C，，PKC)是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞漿內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，具有脂質(zhì)依賴性,至少包括12種亞型。PKCδ是新型PKC(novel PKC, nPKC)家族成員，主要在肝臟組織中發(fā)揮作用。與cPKC和aPKC不同，PKCδ能被游離脂肪酸的代謝產(chǎn)物二酰甘油(diacylglycerol，DAG)激活，并通過激活應(yīng)激活化蛋白激酶(c—junN—terminal kinase，JNK)和CHOP，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，PKCδ激活與糖尿病及其相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。將編碼PKCδ的Prkcd基因經(jīng)整體或者肝特異性敲除后，小鼠肝臟胰島素敏感性得到明顯改善。與高脂飲食飼養(yǎng)野生型同窩對(duì)照小鼠相比較，Prkcd-/-小鼠肝臟和血漿甘油三酯水平及附睪脂肪組織都減少。這些線索提示：在NASH發(fā)生發(fā)展過程中，PKCδ參與肝細(xì)胞脂肪變性過程，其激活很可能是誘導(dǎo)ERS持續(xù)發(fā)生導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變進(jìn)展至NASH發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前尚無PKCδ與ERS之間關(guān)系的研究。因此，本研究目的在于初步探討PKCδ與肝細(xì)胞脂肪變性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，為防治非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)向NASH的演進(jìn)提供新思路。 方法： 1.構(gòu)建肝細(xì)胞株L02脂肪變性體外模型 1.1.人正常肝細(xì)胞株L02培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，造模前細(xì)胞進(jìn)行胎牛血清剝奪過夜。對(duì)照組培養(yǎng)于含1%FAF-BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，脂肪酸組給予0.5mM長(zhǎng)鏈游離脂肪酸(long-chain fatty acids，LCFA)，油酸/棕櫚酸酯，2:1。根據(jù)誘導(dǎo)脂肪變的時(shí)間，脂肪酸組分為2h組、4h組、8h組和16h組。 1.2油紅O染色檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)脂滴含量。 1.3檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量。 2Real-time PCR檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表達(dá)變化。 3Western-blot檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表達(dá)變化。 4檢測(cè)PKCδ對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白Bip、XBP-1s的影響。 4.1利用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)降低PKCδ基因的表達(dá)。 4.2檢測(cè)干擾PKCδ表達(dá)后Bip、XBP-1s的mRNA水平的表達(dá)變化。 4.3檢測(cè)干擾PKCδ表達(dá)后Bip、XBP-1s的蛋白水平的表達(dá)變化。 5檢測(cè)干擾PKCδ表達(dá)后對(duì)L02肝細(xì)胞脂肪變性程度的影響。 6利用SPSS18.0軟件，對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1油酸/棕櫚酸(2:1)體外誘導(dǎo)成功建立L02細(xì)胞脂肪變性模型 油紅O染色檢測(cè)脂肪酸組細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯增多，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)脂滴越為明顯。ImageJ2X圖像分析提示L02細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞平均脂變面積顯示，脂肪酸組較對(duì)照組脂滴含量明顯增多(P0.01)。經(jīng)油酸、棕櫚酸誘導(dǎo)處理后的L02細(xì)胞內(nèi)TG含量也隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。 2Real-time PCR檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表達(dá)變化。 與對(duì)照組相比，脂肪酸組的L02細(xì)胞PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平顯著增加，且具有時(shí)間依賴效應(yīng)(P＜0.05)。 3Western-blot檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表達(dá)變化。 脂肪酸組PKCδ、Bip、XBP-1s蛋白水平的表達(dá)均較對(duì)照組增高。利用PKCδ充分激活所必須的磷酸化位點(diǎn)Thr-505檢測(cè)PKCδ激活狀態(tài)，與對(duì)照組相比，混合脂肪酸刺激L02肝細(xì)胞早期階段，PKCδ磷酸化表達(dá)明顯升高，以4h組最為顯著，后期出現(xiàn)下降趨勢(shì)。 4干擾PKCδ表達(dá)后對(duì)L02細(xì)胞Bip、XBP-1s的影響 Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Bip、XBP-1s的表達(dá)變化，在PKCδ siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，加入脂肪酸培養(yǎng)8h后Bip、XBP-1s表達(dá)雖然仍有升高，但程度明顯低于對(duì)照轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。 干擾PKCδ表達(dá)后對(duì)L02肝細(xì)胞脂肪變性程度的影響 油紅O染色檢測(cè)脂肪變性陽性細(xì)胞率，脂肪酸誘導(dǎo)PKCδ siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞染色陽性率明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(P＜0.01), PKCδ siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TG含量也顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1肝細(xì)胞脂肪變性過程中，PKCδ及其磷酸化表達(dá)、Bip、XBP-1s表達(dá)上調(diào)，具有時(shí)間依賴效應(yīng)。 2通過siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)降低PKCδ表達(dá)能夠有效抑制混合脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白Bip和XBP-1s的表達(dá)，一定程度減輕肝細(xì)胞脂肪變性。 3PKCδ可能是NASH發(fā)生過程中聯(lián)系肝細(xì)胞脂質(zhì)過載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵點(diǎn)。PKCδ的上調(diào)可誘導(dǎo)脂質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積并啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：非酒精性脂肪性肝炎 蛋白激酶C 肝細(xì)胞脂肪變性 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.5
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-12
• 1. 前言12-15
• 2. 材料與方法15-26
• 3. 結(jié)果與分析26-37
• 4. 討論37-42
• 全文結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 文獻(xiàn)綜述 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在 NAFLD“二次打擊”假說中的新角色47-55
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文55-56
• 致謝56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 賴姝婕;陳東風(fēng);;PKCδ及相關(guān)信號(hào)通路在NASH發(fā)生中作用的研究進(jìn)展[J];國(guó)際消化病雜志;2013年02期

2 Xue-Qun Zhang;Cheng-Fu Xu;Chao-Hui Yu;Wei-Xing Chen;You-Ming Li;;Role of endoplasmic reticulum stress in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年07期

  本文關(guān)鍵詞：PKCδ激活對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪變性的調(diào)控作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：331142