發(fā)布時間：2017-04-06 03:12

  本文關鍵詞：基于深度測序從全基因組分析母子患者血清HBV準種多態(tài)性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分基于深度測序從全基因組分析母子患者血清HBV準種多態(tài)性 目的：通過建立一種快速、高通量的方法，能夠同時對多個樣本進行全基因組深度測序，對母子患者血清乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus, HBV）病毒準種進行全基因組重測序，從病毒全基因組水平上了解不同患者或同一患者體內HBV準種多態(tài)性分布特征，分析母子患者體內HBV準種分布的同源性與差異性，為下一步進行疫苗逃逸位點的發(fā)現與鑒定提供依據。 方法：1、制備HBV全基因組序列：以4對母子患者血清HBV病毒顆粒為模板，PCR擴增HBV3.2kb全長DNA。2、構建solexa測序文庫：（1）使用Nextera Technology將HBV DNA的全基因組片段化，處理成5’端帶轉座末端序列的小片段。（2）設計Barcode引物，在轉座末端序列的5’端加上Barcode序列，通過PCR給每個樣本加上標簽。（3）膠回收250bp~500bp的目的片段。（4）通過克隆測序驗證上述構建的測序文庫。3、將所有樣本等量混合后進行兩次solexa測序。4、對測序數據進行生物信息學分析：構建consensus序列，，利用Barcode序列對測序數據進行分庫（分庫標準：與barcode序列5'端去掉2個堿基后的序列完全一致），通過和consensus序列對比過濾低質量數據（過濾標準：Filtered：Reads N3，Poly N15，測序質量值30；Low P-score：HBV同源性90%），通過分析測序誤差、coverage分布情況、香農熵分布情況等參數，評估實驗方法的可行性和重復性；同時進一步比較采用不同PCR擴增方案得到HBV全基因組序列和不同酶濃度處理的HBV全長序列的測序數據的異同，最后分析了母子患者體內病毒準種的同源性和差異。 結果：1、分庫，過濾低質量序列后，兩次測序獲得有用序列的效率分別是30.53%和44.88%，平均每個位點的測序深度分別是1043和2733個堿基。測序誤差分別是0.26%和0.23%，所有樣本均能夠100%覆蓋HBV全基因組。所有樣本的coverage分布均表現為相同的規(guī)律，在nt900、nt1800和nt2500區(qū)域表現為低覆蓋。每個樣本兩次測序在coverage分布的比較上沒有差別（P0.05），但在香農熵的分布比較上，11個樣本中有3個樣本兩次測序有一定差異。2、不同PCR擴增方案獲得HBV全長序列測序得到的數據和不同酶濃度處理的HBV全長序列測序后得到的數據在coverage分布的比較上沒有明顯差異（P0.05），但在香農熵分布的比較上，第一次測序有差異，第二次測序沒有差異（P0.05）。3、母子間準種序列的相對香農熵分布可以聚類，非母子間不能聚類。但是母子間序列在S抗原的A決定簇區(qū)域和P、C、X基因的抗原表位的區(qū)域具有差異。 結論：1、結合Barcode標簽，我們建立了一種高通量的對HBV全基因組進行分析的策略方法，有助于深入分析HBV準種序列特征。 2、結合上述技術，我們對臨床乙肝病毒感染的4對母子樣本進行了準種分析，發(fā)現不同患者和同一患者體內HBV準種分布具有多態(tài)性，并且獲得了患者體內HBV準種的序列在每個核苷酸位點上的頻譜。 3、通過對母子患者體內HBV準種全基因組頻譜的聚類分析，我們發(fā)現母子患者體內的HBV準種的相似性高，而非母子患者體內的HBV準種的相似性低，從而推測子代患者體內的HBV準種來自母親，即HBV的傳播是以垂直傳播為主的。 4、分析母子患者體內的HBV準種全基因組頻譜的差異性，我們發(fā)現，這些差異性位點多位于HBV疫苗作用的S抗原的A決定簇區(qū)域或抗原表位區(qū)域，這為下一步對疫苗逃逸位點的發(fā)現和鑒定提供了依據。 第二部分HBV DNA線性結構與環(huán)化結構在轉染Huh7細胞后HBV復制水平差異的研究 目的：通過比較不同乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）體外復制體系中分泌的乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B e antigen, HBeAg）和病毒顆粒的復制水平，表明采用環(huán)化策略的HBV體外復制體系更適合HBV反轉錄調控的分子機制研究。 方法：1、選擇已經構建好的3種質粒：（1）由CMV啟動的HBV1.1倍體質粒（CMV-HBV1.1）；（2）由CMV啟動的HBV1.3倍體質粒（CMV-HBV1.3）；（3）由T載體上的啟動子啟動的HBV1.3倍體質粒（T-vector-HBV1.3）。2、任選一個質粒用含有BspQI內切酶位點的引物擴增HBV全長（本實驗選擇了CMV-HBV1.1）。使用BspQI限制性內切酶酶切，然后用T4DNA連接酶連接，構建環(huán)化HBV DNA（cyclized-HBV）。3、將三種質粒和環(huán)化的HBV DNA轉染到Huh7細胞中，5天后收集細胞上清進行ELISA分析，收集細胞并提取HBV復制中間體DNA進行Southern印跡分析。 結果：1、成功擴增HBV全長片段并構建了環(huán)化HBV DNA；2、轉染Huh7細胞后，ELISA檢測乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis Bsurface antigen, HBsAg）和乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B e antigen,HBeAg）均為陽性結果；3、從Huh7細胞中提取HBV復制中間體并做Southern印跡分析得到陽性結果。 結論：HBV DNA全長通過環(huán)化連接后轉染Huh7細胞，可有效的觀察其復制表達，并且HBV DNA環(huán)狀結構的復制表達能力優(yōu)于HBV線性結構的表達質粒。
【關鍵詞】：乙型肝炎病毒 solexa測序 準種 乙型肝炎病毒 DNA環(huán)化 復制中間體
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62;R3416
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-12
• ABSTRACT12-16
• 第一部分 基于深度測序從全基因組分析母子患者血清 HBV 準種多態(tài)性16-49
• 前言16-18
• 1 材料與方法18-28
• 2 結果28-40
• 3 討論40-43
• 結論43-44
• 參考文獻44-49
• 第二部分 HBV DNA 線性結構與環(huán)化結構在轉染 Huh 7 細胞后 HBV 復制水平差異的研究49-65
• 前言49-50
• 1 材料與方法50-58
• 2 結果58-60
• 3 討論60-62
• 結論62-63
• 參考文獻63-65
• 附圖65-68
• 文獻綜述68-78
• 參考文獻74-78
• 致謝78-79
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文79-80

【參考文獻】

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1 羅強;蘇懷彬;梁盼盼;袁作為;張文露;黃愛龍;胡接力;;1.1倍全長HBV基因組克隆轉染細胞系的建立[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年16期

  本文關鍵詞：基于深度測序從全基因組分析母子患者血清HBV準種多態(tài)性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：288158