本文關(guān)鍵詞：戊型肝炎病毒ORF3及其候選互作蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：戊型肝炎是一種重要的人獸共患病，主要流行于發(fā)展中國家，既有暴發(fā)流行也有散發(fā)病例，對人類健康造成威脅。戊型肝炎病毒（HEV）是無包膜的單股正鏈RNA病毒，，包含三個(gè)開放閱讀框（ORF）。其中HEVORF3編碼約114個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白的主要功能目前尚不確定。有研究表明它在病毒感染細(xì)胞而引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著極其重要的作用，與各病毒流行株基因型間的差異性相關(guān)，對于HEV疫苗和診斷試劑盒的開發(fā)具有重要意義。本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了HEVORF3及其候選互作蛋白RPS11蛋白，并對兩者的體外相互作用進(jìn)行了初步探究，結(jié)果如下： 本研究以基因4型HEVORF3的cDNA為模版，PCR擴(kuò)增ORF3片段。選取pET28a、pGEX4T1、pET43a為原核表達(dá)載體，并構(gòu)建His-pGEX4T1雙標(biāo)簽表達(dá)載體。將酶切后帶有粘性末端的載體和ORF3片段連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析表明4個(gè)融合蛋白均得到正確、高效表達(dá)。利用Ni-NTA對pET28a-ORF3進(jìn)行純化,BandScan5.0生物圖像分析軟件分析表明：表達(dá)的融合蛋白占菌體蛋白總量量的百分比為55.7%,純化后融合蛋白的純度為41.6%。利用GST柱對pGEX4T1-ORF3進(jìn)行純化,BandScan5.0分析表明：蛋白的表達(dá)量為68.8%,蛋白純度為69.1%。帶有His和GST雙標(biāo)簽的His-pGEX4T1-ORF3蛋白通過Ni-NTA和GST柱兩次純化,分析表明融合蛋白的純度得到了明顯提高,達(dá)到93.8%。帶有NusA促溶標(biāo)簽的pET43a-ORF3通過Ni-NTA純化后,分析其蛋白表達(dá)量為62.3%,純度為88.5%,而且融合蛋白(?)IusA-ORF3的可溶性表達(dá)較高。純化的HEV ORF3蛋白為ORF3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、與其受體蛋白相互作用及戊肝基因工程疫苗的研究提供了基礎(chǔ)。 通過PCR擴(kuò)增RPS11基因,構(gòu)建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表達(dá)載體,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a,菌液PCR篩選陽性結(jié)果。序列測定正確后,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析,融合蛋白均能夠正確、高效表達(dá)。利用GST柱對pGEX4T1-RPS11蛋白進(jìn)行純化,BandScan5.0分析結(jié)果顯示融合蛋白的表達(dá)量為24.6%,純化的融合蛋白純度為95.2%。利用Ni-NTA柱對pET43a-RPS11蛋白進(jìn)行純化,分析顯示融合蛋白的表達(dá)量為48.3%,蛋白純度為95.0%。 通過GST Pull-down方法對純化的ORF3和RPS11融合蛋白的體外相互作用進(jìn)行了初步探究。為ORF3蛋白互作蛋白的篩選和鑒定奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：戊型肝炎病毒 ORF3 原核表達(dá) RPS11
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.6
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1 戊型肝炎病毒的研究概況12-18
• 1.1 病原學(xué)12-14
• 1.2 蛋白晶體結(jié)構(gòu)學(xué)14-15
• 1.3 流行病學(xué)15-17
• 1.4 疫苗的研制17
• 1.5 HEV重組蛋白在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用17-18
• 2 戊型肝炎病毒ORF3的研究進(jìn)展18-22
• 2.1 HEVORF3的分子生物學(xué)特性18-19
• 2.2 HEVORF3的生物功能19-21
• 2.3 ORF3蛋白在基因工程疫苗中的應(yīng)用21-22
• 3 本研究的目的與意義22
• 第二章 戊型肝炎病毒ORF3蛋白的原核表達(dá)及純化22-45
• 1 材料22-24
• 1.1 菌株和質(zhì)粒22-23
• 1.2 主要試劑23
• 1.3 主要儀器23-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 2.1 目的基因的克隆及純化24-25
• 2.2. 重組表達(dá)載體的構(gòu)建25-29
• 2.3 融合蛋白的表達(dá)檢測29-31
• 2.4 融合蛋白的純化31-33
• 3 結(jié)果33-41
• 3.1 HEVORF3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果33-34
• 3.2 HEVORF3片段和載體質(zhì)粒酶切結(jié)果34
• 3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定34-36
• 3.4 融合蛋白的表達(dá)檢測36-38
• 3.5 融合蛋白的純化38-41
• 4 討論41-45
• 第三章 人核糖體40s亞基RPS11蛋白的原核表達(dá)和純化45-56
• 1 材料45-46
• 1.1 菌株及質(zhì)粒45
• 1.2 主要試劑45
• 1.3 主要儀器45-46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-50
• 2.1 目的基因的擴(kuò)增及純化46-47
• 2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建47-48
• 2.3 融合蛋白的表達(dá)檢測48-49
• 2.4 融合蛋白的純化49-50
• 3 結(jié)果50-54
• 3.1 RPS11基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果50-51
• 3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定51-52
• 3.3 融合蛋白的表達(dá)檢測52-53
• 3.4 融合蛋白的純化53-54
• 4 討論54-56
• 第四章 HEVORF3與候選互作蛋白相互作用的初步探究56-61
• 1 材料56
• 1.1 主要試劑56
• 1.2 主要儀器56
• 2 方法56-57
• 2.1 GST-ORF3作為誘餌蛋白的GSTPull-down實(shí)驗(yàn)56-57
• 2.2 GST-RPS11作為誘餌蛋白的GSTPull-down實(shí)驗(yàn)57
• 3 結(jié)果57-59
• 3.1 GST-ORF3作為誘餌蛋白的GSTPull-down結(jié)果57-58
• 3.2 GST-RPS11作為誘餌蛋白的GSTPull-down結(jié)果58-59
• 4 討論59-61
• 第五章 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-71
• 附錄1 溶液配制71-73
• 附錄2 縮略詞表73-74
• 致謝74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表或錄用的論文75

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 畢勝利，江永珍，趙洪蘭，李景元，魯健，曹經(jīng)瑗，劉崇柏;戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其在診斷中的應(yīng)用[J];病毒學(xué)報(bào);1996年02期

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  本文關(guān)鍵詞：戊型肝炎病毒ORF3及其候選互作蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：286210