發(fā)布時間：2017-04-01 18:13

  本文關(guān)鍵詞：HLF在肝纖維化和肝癌中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,每年新發(fā)現(xiàn)的病人約70萬,其中半數(shù)發(fā)生在我國。發(fā)病率高、死亡率高及有效治療手段的缺乏使深入研究肝癌發(fā)病機(jī)制、探尋防治新靶點(diǎn)顯得極為迫切。絕大多數(shù)肝癌病人都有肝纖維化、肝硬化的病史。而肝纖維化是肝臟損傷的一種高度保守的反應(yīng),發(fā)生在幾乎所有與肝細(xì)胞死亡相關(guān)的疾病中。肝纖維化的病因包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、膽汁阻塞性疾病和肝臟自身免疫性疾病等。肝纖維化是一個多細(xì)胞反應(yīng)性疾病,其中肝星狀細(xì)胞發(fā)揮最主要的作用,產(chǎn)生約90%的細(xì)胞外基質(zhì)。肝纖維化晚期發(fā)展為肝硬化,而肝硬化具有很高的癌變風(fēng)險(xiǎn),相當(dāng)一部分最終發(fā)展為肝癌。因此,探尋肝纖維化的治療手段和發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)靶點(diǎn)具有同樣重要的臨床意義。HLF(Hepatic Leukemia Factor)的發(fā)現(xiàn)源于E2A-HLF融合基因的克隆。E2A-HLF是由t(17;19)(q22;p13)易位形成的融合基因(19號染色體短臂13區(qū)的E2A基因與17號染色體長臂22區(qū)的HLF基因融合),最早發(fā)現(xiàn)于兒童前體B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B cell precursor acute lymphoblastic leukemia);當(dāng)時通過Northern-blot檢測發(fā)現(xiàn),HLF的表達(dá)僅限于肝細(xì)胞和白血病細(xì)胞中,因此將其命名為肝細(xì)胞白血病因子。后續(xù)的研究還發(fā)現(xiàn),HLF屬于脯氨酸和酸性氨基酸含量豐富的堿性亮氨酸拉鏈(proline and acidic amino acid-rich basic leucine zipper,PAR bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員；該轉(zhuǎn)錄因子家族另外兩個成員是白蛋白-D位點(diǎn)結(jié)合蛋白(albumin D-site-binding protein, DBP)和毒性當(dāng)量因子(thyrotroph embryonic factor,TEF)。HLF通過形成同型二聚體或與其他PAR bZIP家族成員形成異型二聚體的方式,結(jié)合靶基因啟動子區(qū)特異的DNA序列并激活轉(zhuǎn)錄。PAR bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族與細(xì)胞的生物節(jié)律密切相關(guān)。研究表明,PAR bZIP家族蛋白DBP、TEF和HLF的同時缺失,會導(dǎo)致小鼠壽命縮短,出現(xiàn)心肌肥大、低血壓、低醛固酮等癥狀,并易發(fā)生癲癇而死亡。前期研究發(fā)現(xiàn)HLF與造血干細(xì)胞的分化和功能有關(guān),在造血系統(tǒng)的惡性腫瘤中發(fā)揮重要的作用,同時它還參與肝臟的代謝。但HLF在肝纖維化和肝癌中的作用未見報(bào)道。因此,本課題將系統(tǒng)研究HLF在肝纖維化和肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制,并結(jié)合臨床資料探討其作為肝纖維化和肝癌干預(yù)靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物的可行性。研究方法：1.鑒定并繁殖HLF組成性轉(zhuǎn)座敲除小鼠,建立CCl4及膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型,與對照組比較,研究HLF調(diào)控肝纖維化的作用；2.利用HLF轉(zhuǎn)座敲除小鼠建立DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型,通過與對照組小鼠相比較,研究HLF調(diào)控肝癌發(fā)生的作用；3.構(gòu)建過表達(dá)和干擾HLF的質(zhì)粒,并利用慢病毒系統(tǒng)建立穩(wěn)定過表達(dá)及干擾HLF的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721 micro -HLF、MHCC-LM3 micro -HLF、97H micro-HLF、SMMC-7721 flag -HLF、MHCC-LM3 flag -HLF及其對照細(xì)胞系；4. SMMC-7721 micro -HLF、MHCC-LM3 micro -HLF、97H micro -HLF、 SMMC-7721 flag -HLF、MHCC-LM3 flag -HLF及其對照細(xì)胞系分別采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測、平板克隆實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Invasion chamber遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)及干擾HLF后對肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響；5.將MHCC-LM3 micro -HLF及其對照細(xì)胞分別接種裸鼠皮下,觀察HLF對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響；6.將97H micro -HLF、MHCC-LM3 flag -HLF及其對照細(xì)胞分別進(jìn)行裸鼠尾靜脈注射,建立小鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型,觀察HLF對肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。7.分離HLF組成性轉(zhuǎn)座失活小鼠及對照小鼠原代肝星狀細(xì)胞,利用CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法觀察HLF對肝星狀細(xì)胞活化的影響;8.構(gòu)建過表達(dá)HLF的腺病毒,感染人肝星狀細(xì)胞系LX-2,采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法,觀察過表達(dá)HLF對肝星狀細(xì)胞增殖、遷移、分泌等生物學(xué)特性的影響；9.利用Realtime-PCR, western-blot、免疫共沉淀、表達(dá)譜芯片、ChIp-seq等方法研究HLF對c-Jun、p21和IL-6/STAT3及PTEN/Akt等信號通路的調(diào)控；10.利用RT-PCR, western-blot及免疫組化等方法檢測肝纖維化臨床樣本中HLF的表達(dá)情況并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析HLF的表達(dá)與臨床病人肝纖維化程度的相關(guān)性；11.利用RT-PCR, western-blot及免疫組化等方法檢測肝癌臨床組織樣品中HLF的表達(dá)情況并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析HLF的表達(dá)與臨床病理和預(yù)后資料的相關(guān)性。研究結(jié)果：1.以CCl4和膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化為模型,我們研究發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比較,HLF敲除小鼠的肝纖維化明顯減輕。2.分離原代小鼠肝星狀細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比HLF敲除小鼠肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移和分泌能力顯著下降。3.將表達(dá)HLF的腺病毒感染肝星狀細(xì)胞后進(jìn)行RT-PCR、western blot和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),HLF可通過調(diào)控IL-6/STAT3信號通路促進(jìn)肝纖維化。4.機(jī)制研究的結(jié)果還發(fā)現(xiàn),肝星狀細(xì)胞中HLF的表達(dá)受TGF-3調(diào)控。5.通過對帶有詳細(xì)病理資料的人肝纖維化組織進(jìn)行HLF的western-blot及免疫組化檢測并評分發(fā)現(xiàn),HLF的表達(dá)與肝纖維化的程度呈正相關(guān)。6.利用經(jīng)典的DEN誘癌模型我們發(fā)現(xiàn),HLF敲除組小鼠肝癌發(fā)生率明顯降低,形成腫瘤的數(shù)量和體積也顯著低于對照組小鼠,提示HLF對肝癌發(fā)生具有促進(jìn)作用。7.通過對DEN誘癌小鼠的肝癌與癌旁組織進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn),與對照小鼠相比,HLF敲除小鼠的肝臟癌組織中AP-1家族的表達(dá)差異最大,western blot檢測的結(jié)果驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn),這提示HLF可能通過調(diào)控c-Jun促進(jìn)肝癌的發(fā)生。8.在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)或干擾HLF后進(jìn)行增殖、周期、平板克隆形成及裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HLF可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和裸鼠成瘤能力。9.在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)或干擾HLF后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell、Invasion chamber、裸鼠肺轉(zhuǎn)移檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLF可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外遷移和侵襲的能力。10.通過對過表達(dá)HLF肝癌細(xì)胞系及其對照細(xì)胞系進(jìn)行免疫共沉淀、westernblot蛋白電泳、RT-PCR以及裸鼠皮下荷瘤及裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶上的免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn),HLF可通過調(diào)控p21信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。11.從核酸及蛋白水平驗(yàn)證了HLF在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁,在肝癌轉(zhuǎn)移灶中進(jìn)一步升高,提示HLF與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。12.通過對帶有詳細(xì)臨床病理資料和預(yù)后信息的肝癌組織進(jìn)行HLF的Western-blot及免疫組化檢測并評分,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)肝癌中HLF表達(dá)越高,患者總體生存期和無瘤生存期越短,提示HLF可能是一個潛在的肝癌預(yù)后標(biāo)志物。結(jié)論：本項(xiàng)研究證實(shí)HLF對肝纖維化具有顯著的促進(jìn)作用,機(jī)制研究表明HLF可上調(diào)肝星狀細(xì)胞中IL-6/STAT3信號通路促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化,進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程。我們的研究還證實(shí)星狀細(xì)胞中HLF的表達(dá)受到細(xì)胞外TGF-β調(diào)控。臨床相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLF的表達(dá)與患者肝纖維化程度相關(guān)。利用經(jīng)典的小鼠DEN誘癌模型我們證實(shí)HLF對肝癌發(fā)生具有顯著的促進(jìn)作用,可能通過上調(diào)癌蛋白c-Jun的表達(dá)促進(jìn)肝癌的發(fā)生。HLF對肝癌進(jìn)展的體內(nèi)外研究證實(shí)HLF可通過下調(diào)p21促進(jìn)肝癌的生長,通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。臨床相關(guān)研究證實(shí)肝癌組織中HLF表達(dá)顯著升高,在肝癌轉(zhuǎn)移灶中其表達(dá)更高；HLF表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān),提示HLF高表達(dá)預(yù)示著肝癌患者預(yù)后不良。綜上所述,HLF在肝纖維化和肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起到了重要的促進(jìn)作用,可能是肝癌新的預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 肝星狀細(xì)胞 HLF 肝癌 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7;R575.2
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-12
• 縮略詞表12-13
• 第一部分 HLF在肝纖維化中的作用及機(jī)制研究13-50
• 前言13-15
• 材料和方法15-35
• 一、材料15-18
• 二、儀器設(shè)備18-20
• 三、實(shí)驗(yàn)方法20-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-46
• 一、HLF~(PB/PB)小鼠的鑒定35
• 二、HLF敲除抑制雄性小鼠的肝纖維化35-37
• 三、HLF在肝纖維化的進(jìn)程中不影響肝細(xì)胞和炎癥細(xì)胞37-39
• 四、HLF敲除抑制肝星狀細(xì)胞的活化39-40
• 五、外源導(dǎo)入HLF促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化40-41
• 六、HLF促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化依賴IL-6/STAT3信號通路41-43
• 七、HLF不影響雌性小鼠的肝纖維化43-44
• 八、HLF在肝纖維化進(jìn)程中受TGF-β的上調(diào)44-46
• 討論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 第二部分 HLF在肝癌中的作用及機(jī)制研究50-70
• 前言50-51
• 材料和方法51-58
• 一、材料51-53
• 二、實(shí)驗(yàn)方法53-58
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-66
• 一、HLF促進(jìn)肝癌的發(fā)生58-59
• 二、HLF促進(jìn)肝癌的生長59-61
• 三、HLF促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移61-62
• 四、HLF調(diào)控肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究62-65
• 五、HLF在人肝癌中的表達(dá)和臨床相關(guān)研究65-66
• 討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-70
• 綜述70-79
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況79-81
• 致謝81

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：281070