本文關(guān)鍵詞：去脾臟功能大鼠通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)影響肝纖維化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[背景] 肝纖維化是各種損傷因子累及肝臟后的一種病理狀態(tài),幾乎任何能造成肝臟損害的因素均可致肝臟發(fā)生纖維化。如慢性乙型肝炎,慢性丙型肝炎,脂肪性肝炎,自身免疫性肝病,血吸蟲(chóng)肝病,藥物性肝病和一些先天代謝性疾病等均,可引起肝纖維化。在此病理進(jìn)程中正常功能的肝細(xì)胞數(shù)量減少肝小葉結(jié)構(gòu)改變血液循環(huán)紊亂致肝臟功能逐漸喪失最終發(fā)展為肝硬化。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展人們逐漸認(rèn)識(shí)到肝纖維化是肝臟受損后機(jī)體在修復(fù)過(guò)程中纖維組織在肝組織中過(guò)度沉積的一種可逆性病理現(xiàn)象。部分研究證實(shí)肝纖維化甚至肝硬化患者經(jīng)過(guò)治療以后也會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)因此肝纖維化機(jī)制的闡明有助于阻止或延緩纖維化的發(fā)展。 脾臟作為外周最大的淋巴器官,其免疫功能具有“雙向性”,即脾臟免疫細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放在發(fā)揮抗感染作用的同時(shí)又會(huì)反過(guò)來(lái)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷,同時(shí)具有“時(shí)相性”的特點(diǎn),即免疫功能在某一時(shí)間點(diǎn)免疫的正向保護(hù)作用發(fā)生反轉(zhuǎn),成為負(fù)向的免疫損傷作用。研究表明,一方面在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中行脾臟切除有利于肝損傷修復(fù)的同時(shí)也能夠延緩肝纖維化的發(fā)展,并改善患者肝功能；另一方面,臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)肝硬化合并肝癌患者行肝癌切除聯(lián)合脾臟切除的患者術(shù)后無(wú)瘤生存率明顯優(yōu)于單純行肝癌切除的肝硬化患者。因此,脾臟可通過(guò)某種細(xì)胞因子或者信號(hào)通路影響肝臟組織的自我修復(fù)并影響患者愈后。 PTEN基因,是第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因,是于1997年發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因。它同時(shí)具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性。隨著腫瘤細(xì)胞分子遺傳學(xué)的研究不斷深入,揭示出多種腫瘤的發(fā)生與PTEN基因表達(dá)的缺失或突變存在聯(lián)系,比如：惡性膠質(zhì)瘤、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等。同時(shí),在許多非腫瘤性疾病中也發(fā)現(xiàn)了PTEN基因表達(dá)的異常,如肺纖維化,支氣管哮喘、內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。研究發(fā)現(xiàn),PTEN表達(dá)隨著肝纖維化進(jìn)展而下降,且在體外環(huán)境中PTEN基因表達(dá)與HSC(肝星狀細(xì)胞)的活化及增殖能力成負(fù)相關(guān),然而HSC的活化是肝纖維化的中心事件,在細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、乙醛、氧自由基等的刺激下HSC轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)α-SMA (α平滑肌肌動(dòng)蛋白)的肌成纖維樣細(xì)胞,并在肝損傷部位移行、增殖,產(chǎn)生大量膠原纖維。同時(shí),α-SMA是活化HSC的標(biāo)志,肝組織中α-SMA的表達(dá)可反映HSC活化、增殖的程度。因此,PTEN基因的表達(dá)與肝纖維化密切相關(guān)。 綜上所述,去脾臟功能延緩肝纖維化的發(fā)展與肝纖維化過(guò)程中PTEN基因表達(dá)下降是否存在某種聯(lián)系,有待進(jìn)一步探討,本研究通過(guò)脾臟切除的方式探討脾臟在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中對(duì)PTEN表達(dá)的影響及延緩肝纖維化的可能作用機(jī)制。 [目的] 探討去脾臟功能對(duì)PTEN在大鼠纖維化肝組織中表達(dá)的影響及延緩肝纖維化的相關(guān)作用機(jī)制。 [方法] 1.1實(shí)驗(yàn)分組健康雄性SD大鼠135只,清潔級(jí),體重250±20g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(醫(yī)動(dòng)字第4402101312號(hào))。全部動(dòng)物均在同一實(shí)驗(yàn)室按清潔級(jí)大鼠要求由專(zhuān)人飼養(yǎng),自由進(jìn)食水。將135只大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組：膽總管結(jié)扎+脾臟切除組(A組,45只)、膽總管結(jié)扎+脾臟假手術(shù)組(B組,45只)；對(duì)照組：假手術(shù)組(C組,45只)。A、B、C組分別于結(jié)扎后1周、3周、5周隨機(jī)抽取10只,乙醚吸入麻醉。無(wú)菌條件下切開(kāi)皮膚進(jìn)入腹腔,留取左葉肝組織150mg以備提取蛋白及核酸；另外切取部分肝臟左葉,以4%多聚甲醛固定,用于HE染色、天狼星紅染色及免疫組織化學(xué)法染色。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共死亡27只(其中A組12只,B組14只,C組1只),余18只采用斷頸法處死。 1.2去脾臟功能肝纖維化模型的建立適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,實(shí)驗(yàn)組于術(shù)前8h禁食水,乙醚麻醉后固定,術(shù)區(qū)備皮消毒,鋪無(wú)菌單,乙醚吸入麻醉配合5%的利多卡因注射液局部浸潤(rùn)麻醉滿(mǎn)意后,取左上腹部原手術(shù)切口,逐層切開(kāi)腹壁進(jìn)入腹腔。膽總管結(jié)扎十脾臟切除組(A組)：游離脾臟周?chē)g帶,1號(hào)線(xiàn)雙扎脾的全部血管,行脾切除術(shù),如有副脾一并切除。游離膽總管后,3號(hào)線(xiàn)于近心端及遠(yuǎn)心端雙重結(jié)扎膽總管并離斷,以無(wú)菌棉簽檢查無(wú)膽漏及出血后逐層關(guān)腹。膽總管結(jié)扎+脾臟假手術(shù)組(B組)：游離脾臟周?chē)g帶,保留脾臟,余同上。假手術(shù)組(C組)：術(shù)中游離部分大網(wǎng)膜,游離脾臟周?chē)g帶,后逐層關(guān)腹。術(shù)后12h自由飲用20%葡萄糖,24h后自由進(jìn)食。 1.3數(shù)據(jù)采集及分析采用HE染色及天狼星紅染色法顯示肝纖維化程度；應(yīng)用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定大鼠肝組織中PTEN mRNA、α-SMAmRNA的表達(dá)；應(yīng)用Pearson's相關(guān)性分析分析二者間的相關(guān)性。 [結(jié)果] 1.大鼠肝纖維化病理學(xué)改變隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),A、B兩組大鼠肝臟組織可見(jiàn)不同程度的肝細(xì)胞變性壞死并逐漸出現(xiàn)肝纖維化。造模第5周末A、B、C組行HE染色可見(jiàn),A、B兩組均出現(xiàn)明顯假小葉形成,且B組假小葉出現(xiàn)更多,更為明顯,幾乎看不到正常的肝臟組織結(jié)果,并伴有大量膽汁淤積,C組未出現(xiàn)肝纖維化。天狼星紅染色,C組僅匯管區(qū)、中央靜脈壁有少量膠原纖維。A、B組隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),膠原纖維逐漸增多,且同一時(shí)間點(diǎn),B組肝臟組織分泌的α-SMA明顯較A組多。 2.PTEN蛋白及α-SMA在肝纖維化組織中表達(dá)PTEN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,正常大鼠肝組織中PTEN蛋白有廣泛表達(dá),隨著肝纖維化的進(jìn)展,大鼠肝組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少,相同時(shí)間點(diǎn)B組較A組PTEN表達(dá)減少的更明顯。α-SMA免疫組化結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠肝臟組織中僅少量的表達(dá),主要表達(dá)于血管平滑肌。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),α-SMA在A、B兩組表達(dá)逐步增加,同一時(shí)間點(diǎn)A組表達(dá)較B組少。 3.肝纖維化組織中PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)水平造模1周、3周及5周不同時(shí)間大鼠纖維化肝組織的PTEN mRNA表達(dá)量為A組(1.48±0.21、0.72±0.12、0.57±0.14)均明顯高于B組(0.79±0.21、0.56±0.14、0.33±0.11),兩組間比較有顯著性差異(p0.01)。相同時(shí)間點(diǎn),A組與B組比較均有顯著性差異(p0.05)。PTEN mRNA表達(dá)量與PTEN蛋白的表達(dá)是一致的,即A、B兩組間PTEN蛋白表達(dá)量的比較均有顯著性差異(p0.01)。α-SMA在正常大鼠肝組織中僅在血管壁平滑肌細(xì)胞有弱陽(yáng)性表達(dá)；隨著肝纖維化的發(fā)展,大鼠肝組織中α-SMA表達(dá)量逐步增多,造模1、3周及5周末大鼠肝臟組織中A、B兩組間均有顯著性差異(p0.01)。 4.PTEN蛋白表達(dá)量與α-SMA的相關(guān)性分析對(duì)PTEN蛋白表達(dá)量與α-SMA表達(dá)量進(jìn)行Pearson's相關(guān)性分析,結(jié)果顯示大鼠纖維化肝組織中PTEN表達(dá)量與α-SMA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.86,P0.05)。 [結(jié)論] 1.肝纖維化大鼠模型中,去脾臟功能可上調(diào)PTEN在肝纖維化組織中的表達(dá),并減少α-SMA的分泌從而延緩肝硬化的發(fā)生。 2.膽總管結(jié)扎聯(lián)合脾臟切除是一種行之有效的構(gòu)建去脾臟功能肝纖維化模型的方法。
【關(guān)鍵詞】：α-SMA 肝纖維化 PTEN 脾切除 TGF-β1
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-17
• 實(shí)驗(yàn)材料和方法17-29
• 1 材料17-20
• 2. 動(dòng)物模型建立20-21
• 3. HE染色21-22
• 4. 天狼星紅染色法22
• 5. 免疫組織化學(xué)染色(SP染色)22-23
• 6. 肝組織蛋白提取液的制備23-24
• 7. 考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量24
• 8. 蛋白印跡法(Western blot)24-26
• 9. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Q-PCR)26-28
• 10. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理28-29
• 結(jié)果29-36
• 1. 一般情況29-30
• 2. 病理組織學(xué)變化30-31
• 3. PTEN蛋白及α-SMA在肝纖維化組織中表達(dá)31-33
• 4. 肝纖維化組織中PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)水平33-36
• 討論36-39
• 參考文獻(xiàn)39-45
• 綜述45-56
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 主要中英文詞縮略表56-57
• 發(fā)表論文一覽表57-58
• 致謝58-59

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：277388