本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下靶向干擾PERK基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞模型中自噬的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：急性胰腺炎是發(fā)病率和死亡率很高的一種可導(dǎo)致死亡的疾病,它的病理機(jī)制尚不明確,而且沒有特殊或有效地治療方法[1,2]。普遍認(rèn)為,這個(gè)病始于腺泡細(xì)胞[3]。胰腺炎特征性的表現(xiàn)包括高淀粉酶血癥,消化酶在腺泡內(nèi)異�；罨�(如胰蛋白酶原變?yōu)橐鹊鞍酌?,腺泡細(xì)胞中大空泡的積聚,促炎介質(zhì)的釋放(如關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞侵入胰腺和全身炎癥反應(yīng),凋亡和壞死引起的腺泡細(xì)胞死亡。有數(shù)據(jù)表明,急性胰腺炎中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。組織學(xué)檢測(cè)提示,在目前所有的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?急性胰腺炎的早期均可觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。急性胰腺炎中基因表達(dá)的改變可以闡釋內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。第一部分穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的AR42J細(xì)胞系的建立研究目的:利用慢病毒感染技術(shù)將EGFP-LC3融合蛋白包裝成慢病毒以感染至AR42J細(xì)胞中。研究方法:利用慢病毒過表達(dá)載體Lentiviral-EGFP-LC3,包裝成慢病毒,并利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)以轉(zhuǎn)染大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J。利用倒置熒光顯微鏡鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá)。利用流式細(xì)胞分析儀鑒定感染效果。RT-PCR及western blot檢測(cè)EGFP-LC3在穩(wěn)定細(xì)胞株中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:慢病毒感染AR42J細(xì)胞后,倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞分析儀檢測(cè),感染效率均85%。Western blot實(shí)驗(yàn)表明EGFP-LC3融合蛋白在AR42J細(xì)胞中表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示和未感染組相比,EGFP-LC3組的LC3 m RNA表達(dá)水平明顯上調(diào),其細(xì)胞中LC3 m RNA的表達(dá)是未轉(zhuǎn)染組的9.14±0.32倍,二組差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而EGFP組與未感染組相比較,二者差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J,以及為進(jìn)一步研究急性胰腺炎與自噬的關(guān)系提供了新的細(xì)胞模型。第二部分靶向干擾PERK基因的sh RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)AR42J-LC3細(xì)胞的靶向干擾效果研究目的:運(yùn)用RNA interference干擾技術(shù),構(gòu)建靶向干擾PERK基因的短發(fā)夾環(huán)狀小干擾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)真核表達(dá)載體(慢病毒載體),并采用慢病毒感染技術(shù)將U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-PUR-PERK2-sh RNA穩(wěn)定感染至AR42J-LC3細(xì)胞中,以建立靶向干擾PERK基因的AR42J-LC3細(xì)胞系,可為進(jìn)一步研究急性胰腺炎與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬關(guān)系提供進(jìn)一步的基礎(chǔ)。研究方法:1.利用Gen Bank檢索大鼠PERK基因序列(NM_031599),根據(jù)RNAi序列設(shè)計(jì)原則,并利用Ambion公司在線序列設(shè)計(jì)軟件輔助設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)大鼠PERK基因m RNA的RNAi靶點(diǎn)序列,再運(yùn)用BLAST檢索軟件進(jìn)行檢索,對(duì)上述所設(shè)計(jì)的干擾序列進(jìn)行同源性分析,最后選出3條si RNA作為PERK基因的干擾片段,并利用克隆構(gòu)建真核表達(dá)載體(慢病毒載體),進(jìn)而對(duì)慢病毒載體序列進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。隨后利用共轉(zhuǎn)染技術(shù)將慢病毒載體包裝成慢病毒。2.將AR42J-LC3細(xì)胞分為5組:空白對(duì)照組(Control組)、陰性對(duì)照組(NC組)、PERK-sh RNA-1組、PERK-sh RNA-2組、PERK-sh RNA-3組。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)NC組及各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行感染,隨后應(yīng)用RT-PCR及Western blot鑒定對(duì)照組及各感染組細(xì)胞中PERK mRNA及蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.測(cè)序結(jié)果顯示PERK基因的sh RNA真核表達(dá)載體(慢病毒載體)的構(gòu)建成功,所構(gòu)建的靶向PERK基因的3個(gè)慢病毒載體分別命作PERK-sh RNA-1、PERK-sh RNA-2、PERK-sh RNA-3。2.RT-PCR結(jié)果顯示:以Control組為1進(jìn)行比較,NC組及各實(shí)驗(yàn)組的PERK m RNA表達(dá)量分別為Control組的1.07±0.07倍、0.54±0.04倍、0.37±0.01倍、0.59±0.03倍。NC組與Control組相比較,二者差異無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),各實(shí)驗(yàn)組與Control組相比較均有較大差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。且PERK-sh RNA-2對(duì)PERK m RNA表達(dá)的干擾抑制作用最為明顯。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:Control組、NC組、各實(shí)驗(yàn)組的PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量(PERK/β-actin)分別為:0.69±0.03、0.63±0.04、0.40±0.01、0.21±0.02、0.38±0.01。NC組與Control組相比較,二者差異無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),各實(shí)驗(yàn)組與Control組相比較均有較大差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。且PERK2-sh RNA對(duì)PERK基因蛋白表達(dá)的干擾下調(diào)作用最為明顯,和RT-PCR的結(jié)果相一致。結(jié)論:成功地設(shè)計(jì)完成了對(duì)PERK基因進(jìn)行干擾的shRNA的真核表達(dá)載體的構(gòu)建,進(jìn)而建立穩(wěn)定干擾PERK基因的AR42J-LC3細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究急性胰腺炎與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制及自噬關(guān)系提供了新的體外模型。第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞模型中自噬的影響研究目的:闡明靶向抑制PERK后對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)機(jī)制下急性胰腺炎體外模型中自噬的影響。實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)驗(yàn)分組:AR42J-LC3組為A組,AR42J-LC3-shPERK為B組,空白對(duì)照組(A/B組)、A+雨蛙素組、B+雨蛙素組、A+雨蛙素+毒胡蘿卜素組、B+雨蛙素+毒胡蘿卜素組,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型運(yùn)用毒胡蘿卜素(TG)進(jìn)行處理,使各組作用時(shí)間均為8h,雨蛙素組運(yùn)用雨蛙素(CAE)進(jìn)行處理,作用時(shí)間也為8h。運(yùn)用PT-PCR及Westernblot檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1 m RNA及蛋白的表達(dá)。同時(shí)利用激光共聚焦顯微鏡來觀察自噬的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示下調(diào)PERK可以減少LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化、以及Beclin1的表達(dá)。利用共聚焦顯微鏡觀察自噬變化,發(fā)現(xiàn)下調(diào)PERK后,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下,胰腺炎中自噬體的形成也相對(duì)減少。結(jié)論:進(jìn)一步闡明了PERK參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下胰腺炎中自噬的形成,
【關(guān)鍵詞】：EGFP-LC3 慢病毒感染 AR42J細(xì)胞 穩(wěn)定表達(dá) 自噬 AR42J-LC3細(xì)胞 PERK RNA干擾 shRNA 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 共聚焦顯微鏡 自噬 雨蛙素 毒胡蘿卜素
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R576
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 中英文縮略詞表12-14
• 前言14-18
• 第一部分 穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的AR42J細(xì)胞系的建立18-34
• 一、材料和方法18-26
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-31
• 三、討論31-34
• 第二部分 靶向干擾PERK基因的sh RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)AR42J-LC3細(xì)胞的靶向干擾效果34-49
• 一、材料和方法34-41
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-47
• 三、討論47-49
• 第三部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞模型中自噬的影響49-57
• 一、材料和方法49-52
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-55
• 三、討論55-57
• 全文總結(jié)57-58
• 全文參考文獻(xiàn)58-63
• 綜述63-73
• 參考文獻(xiàn)70-73
• 在讀期間發(fā)表論文73
• 參與科研項(xiàng)目73
• 在讀期間獲獎(jiǎng)情況73-74
• 致謝74

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 吳婷;林珊珊;;抵抗素在伴高脂血癥性急性壞死性胰腺炎大鼠發(fā)病中的作用[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

2 劉杰鋒;何志國(guó);陳澍;余鋮;廖潔;何子超;;早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)輔助治療重癥胰腺炎的臨床療效分析[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年27期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張大鵬;中西醫(yī)結(jié)合治療重癥急性胰腺炎的療效評(píng)價(jià)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

2 張大興;GSK-3β抑制劑LiCl對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究[D];武漢大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 張經(jīng)文;腸道屏障在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用及中西藥物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

2 黃艷;原發(fā)性失眠患者記憶和TNF-α改變[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

3 檀勝華;早期腹腔灌洗對(duì)重癥急性胰腺炎治療的臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

4 楊璇;早期測(cè)定血清B7-H3在急性胰腺炎中的臨床意義[D];蘇州大學(xué);2013年

5 張玉明;內(nèi)臟交感神經(jīng)對(duì)急性壞死性胰腺炎病理生理學(xué)變化的影響[D];河南科技大學(xué);2013年

6 郭徽;基于肺與大腸相表里研究電針促進(jìn)胰腺炎大鼠胃腸動(dòng)力以減輕急性肺損傷的機(jī)理[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2013年

7 陳永欣;滿天星異葒草苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

8 徐紅燕;ICAM-1、NF-kB在大鼠高脂血癥相關(guān)性胰腺炎微循環(huán)障礙中的研究[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2013年

9 林珊珊;抵抗素在伴高脂血癥性急性壞死性胰腺炎大鼠發(fā)病中的作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下靶向干擾PERK基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞模型中自噬的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：272705