本文關鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下靶向干擾PERK基因?qū)τ晖芩卣T導的急性胰腺炎細胞模型中自噬的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：急性胰腺炎是發(fā)病率和死亡率很高的一種可導致死亡的疾病,它的病理機制尚不明確,而且沒有特殊或有效地治療方法[1,2]。普遍認為,這個病始于腺泡細胞[3]。胰腺炎特征性的表現(xiàn)包括高淀粉酶血癥,消化酶在腺泡內(nèi)異�；罨�(如胰蛋白酶原變?yōu)橐鹊鞍酌?,腺泡細胞中大空泡的積聚,促炎介質(zhì)的釋放(如關鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB)導致炎癥細胞侵入胰腺和全身炎癥反應,凋亡和壞死引起的腺泡細胞死亡。有數(shù)據(jù)表明,急性胰腺炎中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。組織學檢測提示,在目前所有的實驗模型中,急性胰腺炎的早期均可觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。急性胰腺炎中基因表達的改變可以闡釋內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應機制。第一部分穩(wěn)定表達EGFP-LC3的AR42J細胞系的建立研究目的:利用慢病毒感染技術將EGFP-LC3融合蛋白包裝成慢病毒以感染至AR42J細胞中。研究方法:利用慢病毒過表達載體Lentiviral-EGFP-LC3,包裝成慢病毒,并利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術以轉(zhuǎn)染大鼠胰腺腺泡細胞AR42J。利用倒置熒光顯微鏡鏡下觀察GFP蛋白的表達。利用流式細胞分析儀鑒定感染效果。RT-PCR及western blot檢測EGFP-LC3在穩(wěn)定細胞株中的表達。實驗結(jié)果:慢病毒感染AR42J細胞后,倒置熒光顯微鏡及流式細胞分析儀檢測,感染效率均85%。Western blot實驗表明EGFP-LC3融合蛋白在AR42J細胞中表達。RT-PCR檢測結(jié)果顯示和未感染組相比,EGFP-LC3組的LC3 m RNA表達水平明顯上調(diào),其細胞中LC3 m RNA的表達是未轉(zhuǎn)染組的9.14±0.32倍,二組差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P0.05),而EGFP組與未感染組相比較,二者差異無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌細胞AR42J,以及為進一步研究急性胰腺炎與自噬的關系提供了新的細胞模型。第二部分靶向干擾PERK基因的sh RNA真核表達載體的構(gòu)建及對AR42J-LC3細胞的靶向干擾效果研究目的:運用RNA interference干擾技術,構(gòu)建靶向干擾PERK基因的短發(fā)夾環(huán)狀小干擾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)真核表達載體(慢病毒載體),并采用慢病毒感染技術將U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-PUR-PERK2-sh RNA穩(wěn)定感染至AR42J-LC3細胞中,以建立靶向干擾PERK基因的AR42J-LC3細胞系,可為進一步研究急性胰腺炎與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及自噬關系提供進一步的基礎。研究方法:1.利用Gen Bank檢索大鼠PERK基因序列(NM_031599),根據(jù)RNAi序列設計原則,并利用Ambion公司在線序列設計軟件輔助設計,設計大鼠PERK基因m RNA的RNAi靶點序列,再運用BLAST檢索軟件進行檢索,對上述所設計的干擾序列進行同源性分析,最后選出3條si RNA作為PERK基因的干擾片段,并利用克隆構(gòu)建真核表達載體(慢病毒載體),進而對慢病毒載體序列進行基因測序鑒定。隨后利用共轉(zhuǎn)染技術將慢病毒載體包裝成慢病毒。2.將AR42J-LC3細胞分為5組:空白對照組(Control組)、陰性對照組(NC組)、PERK-sh RNA-1組、PERK-sh RNA-2組、PERK-sh RNA-3組。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術對NC組及各實驗組進行感染,隨后應用RT-PCR及Western blot鑒定對照組及各感染組細胞中PERK mRNA及蛋白的表達。實驗結(jié)果:1.測序結(jié)果顯示PERK基因的sh RNA真核表達載體(慢病毒載體)的構(gòu)建成功,所構(gòu)建的靶向PERK基因的3個慢病毒載體分別命作PERK-sh RNA-1、PERK-sh RNA-2、PERK-sh RNA-3。2.RT-PCR結(jié)果顯示:以Control組為1進行比較,NC組及各實驗組的PERK m RNA表達量分別為Control組的1.07±0.07倍、0.54±0.04倍、0.37±0.01倍、0.59±0.03倍。NC組與Control組相比較,二者差異無明顯的統(tǒng)計學意義(P0.05),各實驗組與Control組相比較均有較大差異,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。且PERK-sh RNA-2對PERK m RNA表達的干擾抑制作用最為明顯。Western blot檢測結(jié)果顯示:Control組、NC組、各實驗組的PERK蛋白相對表達量(PERK/β-actin)分別為:0.69±0.03、0.63±0.04、0.40±0.01、0.21±0.02、0.38±0.01。NC組與Control組相比較,二者差異無明顯的統(tǒng)計學意義(P0.05),各實驗組與Control組相比較均有較大差異,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。且PERK2-sh RNA對PERK基因蛋白表達的干擾下調(diào)作用最為明顯,和RT-PCR的結(jié)果相一致。結(jié)論:成功地設計完成了對PERK基因進行干擾的shRNA的真核表達載體的構(gòu)建,進而建立穩(wěn)定干擾PERK基因的AR42J-LC3細胞系,為進一步研究急性胰腺炎與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制及自噬關系提供了新的體外模型。第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下對雨蛙素誘導的急性胰腺炎細胞模型中自噬的影響研究目的:闡明靶向抑制PERK后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)機制下急性胰腺炎體外模型中自噬的影響。實驗方法:實驗分組:AR42J-LC3組為A組,AR42J-LC3-shPERK為B組,空白對照組(A/B組)、A+雨蛙素組、B+雨蛙素組、A+雨蛙素+毒胡蘿卜素組、B+雨蛙素+毒胡蘿卜素組,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型運用毒胡蘿卜素(TG)進行處理,使各組作用時間均為8h,雨蛙素組運用雨蛙素(CAE)進行處理,作用時間也為8h。運用PT-PCR及Westernblot檢測自噬相關基因LC3、Beclin1 m RNA及蛋白的表達。同時利用激光共聚焦顯微鏡來觀察自噬的變化。實驗結(jié)果:RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示下調(diào)PERK可以減少LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化、以及Beclin1的表達。利用共聚焦顯微鏡觀察自噬變化,發(fā)現(xiàn)下調(diào)PERK后,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下,胰腺炎中自噬體的形成也相對減少。結(jié)論:進一步闡明了PERK參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下胰腺炎中自噬的形成,
【關鍵詞】：EGFP-LC3 慢病毒感染 AR42J細胞 穩(wěn)定表達 自噬 AR42J-LC3細胞 PERK RNA干擾 shRNA 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 共聚焦顯微鏡 自噬 雨蛙素 毒胡蘿卜素
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R576
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 中英文縮略詞表12-14
• 前言14-18
• 第一部分 穩(wěn)定表達EGFP-LC3的AR42J細胞系的建立18-34
• 一、材料和方法18-26
• 二、實驗結(jié)果26-31
• 三、討論31-34
• 第二部分 靶向干擾PERK基因的sh RNA真核表達載體的構(gòu)建及對AR42J-LC3細胞的靶向干擾效果34-49
• 一、材料和方法34-41
• 二、實驗結(jié)果41-47
• 三、討論47-49
• 第三部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下對雨蛙素誘導的急性胰腺炎細胞模型中自噬的影響49-57
• 一、材料和方法49-52
• 二、實驗結(jié)果52-55
• 三、討論55-57
• 全文總結(jié)57-58
• 全文參考文獻58-63
• 綜述63-73
• 參考文獻70-73
• 在讀期間發(fā)表論文73
• 參與科研項目73
• 在讀期間獲獎情況73-74
• 致謝74

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 吳婷;林珊珊;;抵抗素在伴高脂血癥性急性壞死性胰腺炎大鼠發(fā)病中的作用[J];福建醫(yī)科大學學報;2014年01期

2 劉杰鋒;何志國;陳澍;余鋮;廖潔;何子超;;早期腸內(nèi)營養(yǎng)輔助治療重癥胰腺炎的臨床療效分析[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2013年27期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張大鵬;中西醫(yī)結(jié)合治療重癥急性胰腺炎的療效評價[D];天津醫(yī)科大學;2011年

2 張大興;GSK-3β抑制劑LiCl對重癥急性胰腺炎大鼠肝臟損傷的保護作用及其機制的研究[D];武漢大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 張經(jīng)文;腸道屏障在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機制中的作用及中西藥物干預的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學;2012年

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3 檀勝華;早期腹腔灌洗對重癥急性胰腺炎治療的臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學;2013年

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5 張玉明;內(nèi)臟交感神經(jīng)對急性壞死性胰腺炎病理生理學變化的影響[D];河南科技大學;2013年

6 郭徽;基于肺與大腸相表里研究電針促進胰腺炎大鼠胃腸動力以減輕急性肺損傷的機理[D];成都中醫(yī)藥大學;2013年

7 陳永欣;滿天星異葒草苷對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的保護作用及其機制研究[D];廣西醫(yī)科大學;2014年

8 徐紅燕;ICAM-1、NF-kB在大鼠高脂血癥相關性胰腺炎微循環(huán)障礙中的研究[D];皖南醫(yī)學院;2013年

9 林珊珊;抵抗素在伴高脂血癥性急性壞死性胰腺炎大鼠發(fā)病中的作用[D];福建醫(yī)科大學;2014年

  本文關鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下靶向干擾PERK基因?qū)τ晖芩卣T導的急性胰腺炎細胞模型中自噬的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：272705