發(fā)布時(shí)間：2017-03-21 21:10

  本文關(guān)鍵詞：Huh7.5.1細(xì)胞感染HCV并干擾素治療過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的變化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙型病毒性肝炎是以肝臟為主要靶器官,由丙型肝炎病毒(HCV)所致的感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球感染丙型肝炎病毒的患者約達(dá)1.7億人,肝硬化和HCV相關(guān)的肝細(xì)胞癌(HCC)是丙型肝炎患者的主要死因,對(duì)世界人民的生命安全造成了極大的威脅,因此積極尋找有效治療HCV的辦法顯得至關(guān)重要。 近10年來(lái),丙型病毒性肝炎的治療取得了較大的進(jìn)展,干擾素在其治療過(guò)程中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。從最初的單用α-干擾素(IFNa)臺(tái)療發(fā)展為IFNα與利巴韋林聯(lián)合治療；到近幾年來(lái)提倡采用聚乙二醇化-IFNa(Pegylated Interferona, PEG-IFNa)口上利巴韋林治療,使得持久病毒應(yīng)答率有了很大的提高。然而,在不同的人中α-干擾素的治療效果差異很大。目前α-干擾素功能的實(shí)現(xiàn)和信號(hào)通路的研究已經(jīng)相當(dāng)深入,已有研究證實(shí)JAK/STAT級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)是α-干擾素體現(xiàn)其活性的主要方式,該信號(hào)傳導(dǎo)通路受到多重機(jī)制的嚴(yán)密調(diào)控,其中,抑制性的信號(hào)分子,如SOCS家族,能負(fù)向調(diào)控α-干擾素信號(hào)傳導(dǎo)。最終,a-干擾素的信號(hào)傳導(dǎo)改變了細(xì)胞內(nèi)數(shù)百種基因的表達(dá),通過(guò)這些調(diào)控的基因,α-干擾素實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控。但是對(duì)于α-干擾素對(duì)不同人群治療效果的差異性,尚未有研究對(duì)其機(jī)制進(jìn)行明確的闡述。 基因沉默是真核生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種重要手段。基因沉默一般發(fā)生在兩種水平上,一種是由于DNA甲基化、異染色質(zhì)化以及位置效應(yīng)等引起轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默(tran-scriptional gene silencing,TGS),另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silen-cing,PTGS),即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過(guò)對(duì)目標(biāo)RNA進(jìn)行特異性降解而導(dǎo)致基因失活。這是為了保護(hù)自身,動(dòng)植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種限制外源核酸入侵的防衛(wèi)保護(hù)機(jī)制。 MicroRNA(MiRNA)是細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)表達(dá)豐富、非編碼的高度保守的小RNA,長(zhǎng)度為18-25nt。MiRNA表現(xiàn)出一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的全新機(jī)制,它通過(guò)結(jié)合靶基因的mRNA的3’UTR抑制基因的表達(dá)。MiRNA已經(jīng)被證實(shí)在發(fā)育、感染、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生等多種生理與病理過(guò)程中發(fā)揮作用。從最初發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在,已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了700多個(gè)MiRNA,其中絕大部分MiRNA的生物學(xué)功能是未知的。已有報(bào)道,MiRNA參與免疫應(yīng)答中多方面的調(diào)控作用。但目前為止尚未見(jiàn)報(bào)道MiRNA能夠調(diào)控干擾素的信號(hào)通路進(jìn)而影響抗病毒天然免疫,也沒(méi)有報(bào)道MiRNA參與到干擾素對(duì)免疫細(xì)胞功能的調(diào)控作用。 正是基于上述研究背景,我們?yōu)榱颂綄た赡軐?duì)丙型肝炎病毒(HCV)轉(zhuǎn)染,復(fù)制及清除有作用的MiRNA,我們首先通過(guò)對(duì)pFL-J6JFH-1質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到HCV RNA的轉(zhuǎn)錄體,然后在Huh7.5.1細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到60%～70%匯合度時(shí),把HCV RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)去。轉(zhuǎn)染后第3天,提取感染細(xì)胞內(nèi)的總RNA,并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,與正常Huh7.5.1細(xì)胞作對(duì)比,以確定轉(zhuǎn)染是否成功。然后用IFNa-2B處理上述感染細(xì)胞,48h后再次使用熒光定量PCR對(duì)細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行檢測(cè),并與未經(jīng)任何處理的感染細(xì)胞作對(duì)比。最后采用MiRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)正常Huh7.5.1細(xì)胞,HCV感染后的Huh7.5.1細(xì)胞,以及感染后經(jīng)干擾素治療的Huh7.5.1細(xì)胞分別進(jìn)行了MiRNA的表達(dá)的測(cè)定,并采用2(-ΔΔCT)法分析組間MiRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果經(jīng)過(guò)篩選我們發(fā)現(xiàn)與正常Huh7.5.1細(xì)胞中表達(dá)的MiRNA相比,有13種MiRNA在HCV感染后表達(dá)上調(diào),而在干擾素治療后則出現(xiàn)下調(diào)；另外還有7種MiRNA則在HCV感染后出現(xiàn)表達(dá)下調(diào),而在干擾素治療后則發(fā)生上調(diào)。其中MiRNA10a可能與病毒的復(fù)制及清除過(guò)程有關(guān),MiRNA21可能與HCV病毒侵入導(dǎo)致宿主需要抑制它的轉(zhuǎn)錄有關(guān),MiRNA149可能與抑制病毒的復(fù)制有關(guān)MiRNA152可能與自身免疫耐受相關(guān),還有MiRNA99b, MiRNA200b, MiRNA210,MiRNA616,在HCV感染以及干擾素處理中發(fā)生明顯變化,但未在病毒感染中見(jiàn)到報(bào)道,可能與一些新機(jī)制有關(guān)。 結(jié)論MiRNA10a、MiRNA21、MiRNA149、MiRNA152、MiRNA99b、 MiRNA200b、MiRNA210、MiRNA616等實(shí)驗(yàn)中發(fā)生明顯變化的MiRNA均可能與HCV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、清除過(guò)程有關(guān),需要我們通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去揭示它們之間的關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：丙肝病毒 MiRNA Huh7.5.1細(xì)胞 干擾素治療
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R512.63
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 目次12-13
• 引言13-18
• 1、實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-32
• 4、討論32-36
• 5. 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 綜述40-50
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 作者簡(jiǎn)歷及在讀期間所取得的科研成果50

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：Huh7.5.1細(xì)胞感染HCV并干擾素治療過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的變化的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：260302