本文關(guān)鍵詞：TRADD基因過表達慢病毒的構(gòu)建及其對增生性瘢痕成纖維細胞選擇性抑制的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的 食管支架置入術(shù)后再狹窄的發(fā)病率高，嚴(yán)重影響了支架的應(yīng)用，成為臨床工作中的難點[1]。食管支架置入術(shù)后發(fā)生良性再狹窄的主要原因是成纖維細胞的被動活化與過度增殖，導(dǎo)致肉芽組織增生及纖維化的發(fā)生[2]，可見成纖維細胞增殖與凋亡的失衡是食管再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵因素。在細胞凋亡的相關(guān)信號通路中，死亡受體介導(dǎo)的信號通路是其主要途徑之一。其中，腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白(tumor necrosis factor receptorassociated death domain protein，TRADD)在腫瘤壞死因子-α (TNF-α)介導(dǎo)的細胞凋亡信號通路中發(fā)揮著重要作用。TNF-α的大多生物活性是通過TNF受體1(TNF-reptor1，TNFR1)誘導(dǎo)實現(xiàn)的，TRADD與TNFR1的結(jié)合是TNF/TNFR1介導(dǎo)的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中公認的重要步驟之一。TRADD同其他凋亡結(jié)合蛋白一樣，具有死亡域(death domain, DD)結(jié)構(gòu)。TNF-α首先與TNFR1結(jié)合，進而使位于胞漿中游離的TRADD通過其DD區(qū)域與TNFR1尾部的死亡域DD連接，再依次激活下游靶分子蛋白，從而將TNF-α誘導(dǎo)的程序性死亡信號傳導(dǎo)下去，最終引起細胞凋亡。Sayah等[3]通過比較瘢痕疙瘩和正常瘢痕組織中64個凋亡相關(guān)基因的表達情況時，發(fā)現(xiàn)TRADD是病理性瘢痕疙瘩中低表達的八個基因之一。由此推測：TRADD基因的低表達使TNF-α介導(dǎo)的細胞凋亡通路受到明顯抑制，從而導(dǎo)致增生性瘢痕成纖維細胞的過度增生。 慢病毒(Lentivirus)載體是來源于人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的一種病毒載體，具有表達穩(wěn)定、感染效率高、自身抗原性弱、可操控性強、容納外源目的基因片段大以及可感染非分裂期與分裂期細胞等優(yōu)點[4,5]，在諸多轉(zhuǎn)基因技術(shù)中有著不可比擬的優(yōu)勢。近年來，在基因治療相關(guān)領(lǐng)域的研究中，構(gòu)建同時能提供高效的基因轉(zhuǎn)移率、穩(wěn)定的基因表達和長期可靠的生物安全性的慢病毒轉(zhuǎn)移載體技術(shù)已成為研究的熱點[6,7]。 基于以上的研究背景，本實驗通過構(gòu)建攜帶TRADD基因的慢病毒過表達載體，以增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblast，HSFb)為研究對象，以培養(yǎng)的正常胚胎成纖維細胞(normal fetal fibroblast，NFFb)和正常表皮細胞(Hacat)為對照，在TRADD過表達慢病毒分別轉(zhuǎn)染三組細胞的基礎(chǔ)上，加入TNF-α(10ng/ml)至培養(yǎng)基中刺激細胞。觀察各組細胞的生長情況，分析并闡述外源性TRADD融合蛋白和TNF-α對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響及其機制。試圖為食管支架置入術(shù)后再狹窄的基礎(chǔ)與臨床研究提供理論幫助和新的防治策略。 研究方法 1.構(gòu)建攜帶TRADD基因的慢病毒過表達載體：以購買的TRADD目的基因為模板，通過PCR擴增目的片段，將PCR產(chǎn)物與EcoR I酶切線性化的表達載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro進行同源重組。質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT包裝細胞制備慢病毒，最后采用Real-Time定量PCR法檢測病毒滴度。 2.通過采用細胞免疫熒光法、Western blot法檢測TRADD在未進行慢病毒轉(zhuǎn)染的HSFb、NFFb中的蛋白表達水平。 3.選擇最佳感染指數(shù)(MOI值)后，進行慢病毒轉(zhuǎn)染HSFb、NFFb及Hacat。并采用Western blot法定性檢測轉(zhuǎn)染后TRADD-GFP-FLAG融合蛋白的表達情況。 4.三組細胞分別分成六組：未轉(zhuǎn)染組(空白組)、未轉(zhuǎn)染+TNF-α組(空白組+TNF-α)；轉(zhuǎn)染對照病毒組(對照組)、轉(zhuǎn)染對照病毒+TNF-α組(對照組+TNF-α)；轉(zhuǎn)染TRADD慢病毒組(實驗組)、轉(zhuǎn)染TRADD慢病毒+TNF-α組(實驗組+TNF-α)。采用MTT法檢測各組細胞在慢病毒轉(zhuǎn)染前后以及協(xié)同10ng/ml TNF-α藥物濃度誘導(dǎo)前后的細胞增殖情況。 實驗結(jié)果 1.成功構(gòu)建TRADD基因慢病毒表達載體，病毒滴度為3.22×108IU/ml。 2.細胞免疫熒光法和Western blot法檢測結(jié)果顯示：內(nèi)源TRADD在HSFb中的蛋白表達量明顯低于NFFb中的表達量，兩組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。 3.慢病毒轉(zhuǎn)染HSFb、NFFb和Hacat的感染指數(shù)MOI100時，轉(zhuǎn)染效率最高，約80%，因此最佳感染指數(shù)為MOI100。在此條件下進行TRADD慢病毒轉(zhuǎn)染細胞后，Western blot法檢測顯示：TRADD-GFP-FLAG融合蛋白能夠得到有效的表達，可用于后續(xù)實驗研究。 4.采用MTT法檢測不同組間細胞生長情況，結(jié)果顯示： (1)NFFb：從24h開始，對照組細胞增長速度明顯快于空白組和實驗組，實驗組和空白組的細胞生長速度無明顯差異；10ng/ml TNF-α藥物濃度對細胞的生長無明顯抑制作用。 (2)HSFb：三組細胞生長速度從快到慢依次為：對照組，空白組，實驗組；10ng/mlTNF-α藥物濃度對細胞的生長無顯著影響。 (3)Hacat：空白組細胞生長速度顯著快于對照組和實驗組，48h后，實驗組和對照組細胞生長速度無明顯差異；在72-96h內(nèi)，，10ng/ml TNF-α藥物濃度對空白組、對照組和實驗組細胞有促進作用。 實驗結(jié)論 1.成功構(gòu)建TRADD基因慢病毒過表達載體，在增生性瘢痕成纖維細胞、正常胚胎成纖維細胞和Hacat中表達的TRADD-GFP-FLAG融合蛋白具有生物學(xué)活性。 2.在增生性瘢痕成纖維細胞中，內(nèi)源性TRADD蛋白表達量顯著低于其在正常胚胎成纖維細胞中的表達量，提示TRADD可能參與了增生性瘢痕的形成。 3.10ng/ml TNF-α藥物濃度對增生性瘢痕成纖維細胞和正常胚胎成纖維細胞的增殖無明顯作用，對Hacat細胞的生長有顯著的促進作用。 4.過表達TRADD-GFP-FLAG融合蛋白可抑制成纖維細胞增殖活性，對Hacat細胞無影響。提示在成纖維細胞中，TRADD是TNF-α介導(dǎo)的細胞凋亡信號通路中重要的分子之一；在Hacat細胞中，TRADD則不是該通路中的關(guān)鍵分子。 5. TRADD慢病毒感染兩種成纖維細胞后，TRADD的蛋白表達均顯著上調(diào)，MTT結(jié)果顯示TRADD慢病毒選擇性抑制了增生性瘢痕成纖維細胞的增殖，對正常胚胎成纖維細胞的生長無顯著影響。提示死亡蛋白TRADD蛋白的大量表達，可能激活TNF-α介導(dǎo)的兩種誘導(dǎo)反應(yīng)——凋亡和NF-κB激活引起的細胞存活。在生理情況下，兩條通路之間存在著某種平衡機制，使細胞的增殖與凋亡盡量維持正常狀態(tài)。
【關(guān)鍵詞】：TRADD 增生性瘢痕成纖維細胞 胚胎成纖維細胞 Hacat 慢病毒 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R571
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 前言11-13
• 第一部分 TRADD 基因慢病毒載體的構(gòu)建及滴度測定13-34
• 實驗材料13-15
• 實驗方法15-25
• 實驗結(jié)果25-32
• 討論32-34
• 第二部分 TRADD 慢病毒載體對增生性瘢痕成纖維細胞選擇性抑制的實驗研究34-54
• 實驗材料35-36
• 實驗方法36-41
• 實驗結(jié)果41-52
• 討論52-54
• 全文結(jié)論54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻56-59
• 文獻綜述59-65
• 參考文獻63-65
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的論文65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：TRADD基因過表達慢病毒的構(gòu)建及其對增生性瘢痕成纖維細胞選擇性抑制的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：256466