本文關鍵詞：乙型肝炎病毒DNA X蛋白突變預測乙肝相關性肝細胞肝癌患者術后生存率的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學》 2015年

乙型肝炎病毒DNA X蛋白突變預測乙肝相關性肝細胞肝癌患者術后生存率的研究

王文帥  

【摘要】：目的:構成乙型肝炎病毒基因組的4個讀碼框是重疊開放的,各自編碼一種蛋白。其中X基因重疊包繞啟動子與增強子2,前核心區(qū)和核心區(qū)域的轉錄作用受以上兩個因子控制。由于乙型肝炎病毒聚合酶的校對缺陷,導致乙型肝炎病毒DNA容易發(fā)生突變。HBV基因型和病毒DNA載量均和乙肝相關性肝細胞肝癌的發(fā)病相關聯(lián),除此之外,前S1、前S2、BCP和增強子2區(qū)域的基因突變也參與到乙肝相關性肝細胞肝癌的風險的病例對照研究中。有研究表明這上述區(qū)域中的幾種基因突變與肝細胞癌的發(fā)展存在相關性。然而,目前只有少數(shù)針對乙肝相關性肝細胞肝癌患者中上述基因突變的預后價值的研究,尤其針對HBX基因區(qū)域。通過測定肝組織樣本中乙型病毒性肝炎DNA,Yeh等人發(fā)現(xiàn)核心啟動子組分A1752T/1764A的突變是肝細胞癌患者術后預后的獨立預測因子。在當前的研究中我們通過利用來自乙肝相關性肝細胞肝癌患者肝癌組織樣本中的乙肝病毒DNA測定出乙型肝炎病毒X的基因序列,并用該序列來鑒定識別與術后生存相關的基因突變序列。方法:1研究對象及隨訪:選取2007-2009兩年間在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院肝膽外科行肝癌切除術的患者,通過影像學檢查、組織病理明確診斷為肝細胞肝癌。采集肝細胞癌患者術中切除的肝癌組織標本,并準確記錄所有患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、Child分級等臨床特征。通過門診復查、電話等方式隨訪肝癌患者術后的生存情況,隨訪時間截止到2014年12月。2基因組DNA提取、擴增及測序:用DNA純化試劑盒提取肝癌組織標本的基因組DNA,鑒定合格后,采用PCR技術擴增目的片段,設計兩對引物對目的片段進行擴增,引物分別為:HBV1F:5'-ATGCGTGGAACCTTTGTG-3',HBV1R:5'-TCGGTCGTTGACATTGCT-3';HBV2F:5'-CACCTCTGCACGTAGCAT-3',HBV2R:5'-TCCCATACAGAGCAGAG-3'。擴增所得DNA產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測證實后送測序,每個標本選用雙向重復測序。3統(tǒng)計分析:單因素分析中使用Kaplan-Meier的方法來生成生存曲線,曲線之間的比較所用的方法是對數(shù)秩檢驗。多因素分析采用Cox風險回歸模型。實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。結果:1乙肝相關性肝細胞肝癌患者的一般特征。本研究包括總共106例乙肝相關性肝細胞肝癌患者,對這些患者每3個月進行一次隨訪,隨訪時間3年。其間有7例患者失去聯(lián)系,失訪率低于20%,對分析研究無影響。將上述肝癌DNA從肝細胞癌組織中提取用于病毒學分析,平均乙肝病毒DNA水平是5×109±2.616×1010復制量/微克,其中最大復制量1.97×1011,最小復制量1.39×104。經DNA序列測定,本研究發(fā)現(xiàn)在HBV X區(qū)域存在114個核苷酸突變。檢測發(fā)現(xiàn)突變率最高的位點是1386核苷酸位點,有74例患者存在此突變。經統(tǒng)計學相關性分析,乙肝病毒DNA復制水平與基因突變數(shù)量并無相關性(P=0.146)。2本研究選擇攜帶B型或C型乙肝病毒基因型的共94例肝細胞肝癌術后患者進行生存分析。選擇可能影響術后生存率的臨床特征(性別、年齡、腫瘤數(shù)目、Child分級、基因型、腫瘤大小、TNM分期、門脈瘤栓)進行單因素分析。結果顯示,肝細胞癌術后男性與女性的3年生存率比較無差異(P=0.415);年齡分組以55歲為界限,比較≤55歲與55歲兩組的3年生存率無統(tǒng)計學意義(P=0.324);肝細胞癌患者的腫瘤數(shù)目(單發(fā)與多發(fā),P=0.922)、Child分級(A與B,P=0.446)、TNM分期(Ⅰ期與Ⅱ期+ⅢA期+ⅢB期,P=0.227)與患者術后生存時間無關。然而,腫瘤大小(≤55與55歲,P=0.016)、門脈瘤栓(有與無,P=0.001)與這些患者的術后生存率相關聯(lián)。經過DNA測序,統(tǒng)計發(fā)生突變的核苷酸位點,發(fā)現(xiàn)高于5%突變率的突變位點總共有21個,這些位點用于生存分析研究。在21個突變位點中,經過秩檢驗和Kaplan-Meier法分析,以下7個位點突變在統(tǒng)計學重要水平上影響肝癌術后生存率:1383,1461,1485,1544,1613,1653和1762。基于Cox比例風險模型的多變量生存分析,結果表明門脈瘤栓是乙肝相關性肝細胞肝癌患者術后生存率的獨立影響因素。在突變位點中,以下4個突變位點是乙肝相關性肝細胞肝癌患者術后生存率的獨立影響因素:1461(相關風險(RR)3.162,95%置信區(qū)間(CI)1.319-7.582,P=0.010),1485(RR 1.989,95%CI 1.054-3.751,P=0.034),1544(RR 2.602,95%CI 1.040-6.513,P=0.041),1653(RR 2.652,95%CI 1.184-5.938,P=0.018)。3病毒學參數(shù)與肝癌病人術后生存率的相關性病毒學因素中,患者的基因型、HBV DNA復制水平、E抗原狀態(tài)和突變數(shù)目通過Kaplan-Meier生存分析法進行比較,結果顯示:HBV DNA復制水平(6.0E+08與≥6.0E+08,P=0.061)與肝癌患者術后生存率的關系在重要水平的臨界線上,而患者的基因型、E抗原狀態(tài)、突變數(shù)目與肝癌患者術后生存時間不相關。結論:我們研究的HBV X基因的4個核苷酸位點突變:1461、1485、1544、1653是乙肝相關性肝細胞肝癌患者術后生存率的獨立影響因素。在臨床特征中,門脈瘤栓是乙肝相關性肝細胞肝癌患者術后生存率的獨立影響因素。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7;R512.62
【目錄】：

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