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《蘇州大學(xué)》 2013年

慢病毒載體介導(dǎo)Runx3基因過表達(dá)對慢性乙型肝炎患者外周血Th細(xì)胞分化的影響

張毅  

【摘要】：第一部分慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+T細(xì)胞Runx3的表達(dá) 目的探討慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+T細(xì)胞Runx3mRNA的表達(dá)及意義。 方法選取37例慢性乙型肝炎患者和19例健康對照者，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血CD4~+T細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時定量PCR檢測CD4~+T細(xì)胞Runx3mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果慢性乙型肝炎組Runx3mRNA的表達(dá)水平（0.48±0.09）較健康對照組（0.79±0.17）明顯降低（P0.01）。 結(jié)論Runx3基因可能參與了慢性乙型肝炎的發(fā)病過程。 第二部分人Runx3基因重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 目的構(gòu)建人Runx3基因重組慢病毒載體。 方法PCR擴(kuò)增人Runx3基因，應(yīng)用In-Fusion技術(shù)將Runx3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交換進(jìn)入線性化慢病毒載體pGC-FU以構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-Runx3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。對長出的陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，并進(jìn)行測序和比對分析。將構(gòu)建成功的重組慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-Runx3與包裝質(zhì)粒pHelper1.0、包膜質(zhì)粒pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。熒光顯微鏡下觀察重組慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-Runx3轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光表達(dá)情況。Western blot檢測Runx3與EGFP融合蛋白表達(dá)情況。實(shí)時定量PCR測定病毒滴度。 結(jié)果重組慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-Runx3經(jīng)測序和比對分析證實(shí)目的基因序列正確。三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)可見明顯的綠色熒光。Western blot證實(shí)Runx3與EGFP融合蛋白在293T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。濃縮病毒后測定滴度為2.0×10~8TU/ml。 結(jié)論成功構(gòu)建攜帶人Runx3基因的重組慢病毒載體pGC-FU-Runx3。 第三部分Runx3基因過表達(dá)對慢性乙型肝炎患者外周血Th細(xì)胞分化的影響 目的探討Runx3基因過表達(dá)對慢性乙型肝炎患者外周血Th細(xì)胞分化的影響。 方法重組慢病毒載體pGC-FU-Runx3與陰性對照慢病毒載體pGC-FU分別轉(zhuǎn)染29例慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+T細(xì)胞，，收集培養(yǎng)3d、5d和7d的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，應(yīng)用ELISA檢測Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10的表達(dá)水平。收集培養(yǎng)5d的CD4~+T細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時定量PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果1.與pGC-FU轉(zhuǎn)染組比較，pGC-FU-Runx3轉(zhuǎn)染組Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平在3d（P0.05）、5d（P0.01）和7d（P0.01）時均明顯升高；IL-2的表達(dá)水平在3d時無顯著性差異（P0.05），但在5d（P0.05）和7d（P0.01）時均明顯升高。2.與pGC-FU轉(zhuǎn)染組比較，pGC-FU-Runx3轉(zhuǎn)染組Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)水平在3d時無顯著性差異（P0.05），但在5d（P0.01）和7d（P0.05）時均明顯降低；IL-10的表達(dá)水平在3d時無顯著性差異（P0.05），但在5d和7d時均明顯降低（P均0.05）。3.與pGC-FU轉(zhuǎn)染組比較，pGC-FU-Runx3轉(zhuǎn)染組IFN-γ/IL-4比值在3d、5d和7d時均明顯增大（P均0.01）。4.與pGC-FU轉(zhuǎn)染組比較，pGC-FU-Runx3轉(zhuǎn)染組T-bet、GATA3mRNA的表達(dá)水平無顯著性差異（P0.05），但pGC-FU-Runx3轉(zhuǎn)染組T-bet/GATA3比值較pGC-FU轉(zhuǎn)染組明顯增大（P0.01）。 結(jié)論Runx3基因過表達(dá)可促進(jìn)慢性乙型肝炎患者Th1型細(xì)胞因子的分泌，抑制Th2型細(xì)胞因子的分泌，促使慢性乙型肝炎患者外周血Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，使其Th1/Th2失平衡得到改善。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62
【目錄】：

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