本文關(guān)鍵詞：亞硝酸鹽對慢性酒精性肝纖維化的干預(yù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

            膠原纖維在 HE 染色法被染成粉紅色，這些往往跟淀粉樣物難以區(qū)別，因為它還可以用一些陰離子的染料來進(jìn)行染色，如用淡綠可把它們?nèi)緸榫G色，用甲苯胺藍(lán)可將其染為藍(lán)色，Masson 法染色原理與陰離子染料分子的大小和組織的滲透性有關(guān)，可將膠原纖維染為藍(lán)色或綠色，組織的滲透性取決于組織的結(jié)構(gòu)密度。組織和細(xì)胞成分都是多孔的構(gòu)造，不同組織和細(xì)胞成分空隙大小不同，空隙大小決定組織滲透性。Masson 染色液中酸性品紅屬于小分子物質(zhì)，可進(jìn)入固定后的正常紅細(xì)胞和肝細(xì)胞，而其中的苯胺藍(lán)屬于大分子物質(zhì)，可進(jìn)入細(xì)胞膜腫脹的細(xì)胞和新形成的膠原纖維中。本研究預(yù)實驗時通過灌胃給小鼠酒精 10W，就發(fā)現(xiàn)了部分小鼠明顯的肝脂肪變性和纖維組織增生。
         為了研究慢性酒精暴露對肝臟纖維化或硬化的影響，本實驗進(jìn)行了為期 20 W（5 個月）的慢性酒精灌胃，同時用亞硝酸鹽灌胃干預(yù)，，結(jié)果如圖 3-4 Masson 染色顯示,對照組和單純亞硝酸鹽處理組肝細(xì)胞被酸性品紅染成紅色，未見纖維組織增生；模型組小鼠局部肝細(xì)胞腫大，肝細(xì)胞局灶性壞死常見，壞死的肝細(xì)胞被浸潤的炎癥細(xì)胞取代，腫大的肝細(xì)胞漿被苯胺藍(lán)染成藍(lán)灰色，肝小葉內(nèi)可見大量膠原纖維增生，編織成束，分割肝小葉，形成許多假小葉（圖 3-4 C 假小葉中央靜脈偏位，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松）；與模型組相比，亞硝酸鹽干預(yù)組肝細(xì)胞大小基本正常，細(xì)胞質(zhì)被苯胺藍(lán)著色淺，可見肝小葉內(nèi)有少量膠原纖維。3.7 亞硝酸鹽干預(yù)對慢性酒精性肝纖維化小鼠肝細(xì)胞上皮間質(zhì)-轉(zhuǎn)化的影響正常的肝細(xì)胞內(nèi)含有豐富的白蛋白，不含有纖維特異性蛋白，而肝星形細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞之內(nèi)含有纖維特異性蛋白，利用白蛋白和纖維特異性蛋白免疫熒光染色可區(qū)分肝細(xì)胞和肝內(nèi)星形細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。
         圖 3-5 顯示的是用白蛋白（綠色熒光）和纖維特異性蛋白（紅色熒光）標(biāo)記的免疫熒光雙標(biāo)記激光共聚焦圖片。對照組肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)白蛋白豐富，未顯示紅色熒光，肝內(nèi)星形細(xì)胞呈紅色熒光，散落于肝細(xì)胞之間，未與肝細(xì)胞共定位。在模型組可見肝細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度減弱，意味著肝細(xì)胞白蛋白合成明顯較少，許多區(qū)域的肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光，這意味著肝細(xì)胞內(nèi)存在纖維特異性蛋白，也就是說肝細(xì)胞獲得了一定的間質(zhì)纖維細(xì)胞表型。在亞硝酸鹽干預(yù)組，肝細(xì)胞內(nèi)白蛋白含量高于模型組，肝細(xì)胞內(nèi)紅色和綠色熒光共定位的現(xiàn)象也較模型組少見。為了進(jìn)一步驗證慢性酒精暴露對肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，本課題利用免疫熒光雙標(biāo)記法進(jìn)一步檢測了肝組織內(nèi) E-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)情況。結(jié)果如圖 3-6 所示，可見對照組 E-cadherin 分布均勻，僅在星形細(xì)胞內(nèi)可見 Vimentin 蛋白表達(dá)。在模型組，大部分正常肝細(xì)胞表達(dá) E-cadherin，而位于匯管區(qū)周邊的部分肝細(xì)胞 E-cadherin 表達(dá)明顯減少，而在這些肝細(xì)胞內(nèi)有 Vimentin 表達(dá)，另外可見大量星形細(xì)胞增生。在亞硝酸鹽干預(yù)組，星形細(xì)胞數(shù)量以及同一肝細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 表達(dá)下降，Vimentin 表達(dá)升高的現(xiàn)象較模型組減少。
          為了進(jìn)一步驗證亞硝酸鹽對慢性酒精性肝纖維化的干預(yù)作用，本實驗又將部分新鮮肝組織標(biāo)本勻漿，提取蛋白質(zhì)，用 western blotting 方法檢測了纖維特異性蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖 3-7，亞硝酸鹽可以明顯減輕肝組織內(nèi)膠原纖維的含量。3.8 亞硝酸鹽干預(yù)對慢性酒精性肝纖維化小鼠肝細(xì)胞 HIF-1α蛋白表達(dá)的影響為了了解慢性酒精暴露對肝臟組織內(nèi)造成的缺氧情況，本課題利用免疫熒光技術(shù)檢測了缺氧標(biāo)志物 HIF-1α 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖 3-8 所示，對照組和單純亞硝酸鹽組肝細(xì)胞內(nèi)有微弱的綠色熒光，顯示 HIF-1α 蛋白的表達(dá)不強(qiáng)；在模型組，可見匯管區(qū)一些肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，提示這些細(xì)胞內(nèi) HIF-1α蛋白累積，而亞硝酸鹽干預(yù)組這種情況雖然存在，但相對模型組要輕。

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