發(fā)布時(shí)間：2016-11-21 07:12

  本文關(guān)鍵詞：急性胰腺炎時(shí)自噬變化的意義及干擾素γ對(duì)自噬影響的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第二軍醫(yī)大學(xué)》 2013年

急性胰腺炎時(shí)自噬變化的意義及干擾素γ對(duì)自噬影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉曉  

【摘要】：研究背景 急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床常見(jiàn)的急癥，國(guó)外報(bào)告其發(fā)病率10/105～44/105，近年來(lái)呈升高趨勢(shì)。約20%患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎，病死率高達(dá)15%～30%，病情危重，預(yù)后兇險(xiǎn)，已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的重要?dú)⑹帧１M管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)急性胰腺炎的防治進(jìn)行了多年的研究，但迄今還沒(méi)有針對(duì)急性胰腺炎特效的防治措施。因此，深入研究AP的發(fā)病機(jī)制，探索其啟動(dòng)的關(guān)鍵過(guò)程，不僅具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值，而且將有助于尋找和建立有針對(duì)性的救治方法，以期提高急性胰腺炎的救治水平，具有重要的的意義。 自噬是廣泛存在于真核生物中的生命現(xiàn)象，屬程序性細(xì)胞死亡的一種。自噬發(fā)生時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)形成“雙層膜”結(jié)構(gòu)的囊泡即自噬體，包裹胞質(zhì)成分和某些細(xì)胞器碎片，送入溶酶體中并進(jìn)行多種酶的消化及降解，為細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)提供能量和小分子物質(zhì)。自噬是急性胰腺炎早期發(fā)生的事件，在急性胰腺炎中的作用機(jī)制存在很多爭(zhēng)議。有學(xué)者采用敲除自噬相關(guān)基因小鼠研究后發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎減輕，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白減少，推測(cè)自噬在急性胰腺炎中被誘導(dǎo)增強(qiáng)，自噬對(duì)胰腺起損害作用；有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎中長(zhǎng)壽蛋白的降解大大減少（長(zhǎng)壽蛋白通過(guò)自噬途徑降解），大量空泡聚集，認(rèn)為自噬在急性胰腺炎中下降，自噬對(duì)胰腺起保護(hù)作用；另外有學(xué)者認(rèn)為自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，自噬過(guò)程在急性胰腺炎中被破壞，自噬和胰腺炎起相互促進(jìn)作用。這些相互矛盾結(jié)果顯示自噬在急性胰腺炎發(fā)生中存在很大的爭(zhēng)議。 干擾素γ是一種來(lái)自T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清的蛋白，，具有免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞增殖作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)干擾素γ可促進(jìn)自噬。另有文獻(xiàn)報(bào)告干擾素γ對(duì)急性胰腺炎有一定影響。為了進(jìn)一步探討自噬在急性胰腺炎發(fā)生過(guò)程中的變化及其病理意義，并觀察干擾素γ對(duì)急性胰腺炎及自噬的影響，并探討其作用機(jī)制，擬開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)研究。 研究目標(biāo) 1.建立大鼠重癥急性胰腺炎模型。觀察急性胰腺炎發(fā)生過(guò)程中自噬活性的變化，探討其病理意義。 2.觀察干擾素γ對(duì)急性胰腺炎炎癥及自噬的影響，初步探討其機(jī)制。 研究方法圍繞上述目標(biāo)，本研究采用以下研究方法： 1．動(dòng)物模型的建立 采用左旋精氨酸400mg/100g（腹腔注射，2次，間隔1小時(shí)）方法，構(gòu)建急性胰腺炎大鼠模型。 2．電鏡 大鼠新鮮胰腺組織取下后立即置于25%戊二醛電鏡固定液中，切成1mm3大小組織塊，送電鏡室，于透射電鏡下觀察自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。 3．ELISA 造模取血，離心，上清用RD試劑盒行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)AMY、TAP的濃度及IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平。 4．HE染色 標(biāo)本置于4％中性緩沖甲醛中固定24小時(shí)，組織脫水石蠟包埋，室溫保存，行HE染色后觀察胰腺炎癥程度。 5．免疫組化 經(jīng)漂洗，封閉，一抗和二抗孵育后檢測(cè)LC3、Beclin-1、Lamp-2等蛋白在胰腺組織中的表達(dá)。 6．Western Blot 經(jīng)過(guò)提取蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記一抗和二抗、曝光等步驟觀察LC3、Beclin-1、Lamp-2、GAPDH等蛋白的表達(dá)。 7. qRT-PCR 通過(guò)RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的方法檢測(cè)胰腺組織LC3、Beclin-1、Lamp-2、Ⅲ型PI3K、GAPDH等蛋白的基因表達(dá)。 8．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件X進(jìn)行分析，取P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示；兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時(shí)采用LSD-t或SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3或Dunnett's C檢驗(yàn)。 研究結(jié)果 1．20%L-精氨酸腹腔注射可構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型 先后采用250mg/100g、300mg/100g、400mg/100g和500mg/100g等不同給藥劑量的20%L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建重癥急性胰腺炎大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)400mg/100g的劑量腹腔注射2次，間隔1小時(shí)造模，可成功建立重癥急性胰腺炎大鼠模型。 2．急性胰腺炎誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生 免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，大鼠急性胰腺炎模型組自噬相關(guān)因子LC3、Beclin-1的蛋白與mRNA表達(dá)顯著上調(diào)；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎組大鼠胰腺組織自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)明顯多于對(duì)照組。結(jié)果證實(shí)急性胰腺炎可誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生。 3．調(diào)控自噬可影響胰蛋白酶原的活化程度和急性胰腺炎的損傷程度 分別采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（RAP）和自噬阻斷劑氯喹（CQ）及3-甲基腺嘌呤（3-MA）調(diào)控自噬活性，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬后TAP明顯升高，阻斷自噬后TAP下降；SAP9h后誘導(dǎo)劑組大鼠胰腺壞死病理評(píng)分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組與急性胰腺炎組無(wú)明顯差別，24h后誘導(dǎo)劑組胰腺壞死評(píng)分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組胰腺壞死評(píng)分低于急性胰腺炎組。結(jié)果表明急性胰腺炎時(shí)自噬可促進(jìn)胰蛋白酶原的激活，并參與胰腺的損傷。 4．干擾素γ在急性胰腺炎時(shí)可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生及自噬體和溶酶體的融合 與急性胰腺炎對(duì)照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ，免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)均表明自噬相關(guān)因子LC3及Beclin-1的蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；溶酶體相關(guān)膜蛋白-2（Lamp-2）蛋白和基因表達(dá)亦明顯上調(diào)。結(jié)果表明干擾素γ可進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并促進(jìn)自噬體和溶酶體的融合。 5．干擾素γ能促進(jìn)胰蛋白酶原的激活和加重急性胰腺炎時(shí)胰腺的損傷 與急性胰腺炎對(duì)照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ后胰腺水腫、炎癥、壞死、出血評(píng)分明顯增高；血漿炎癥因子IL-6濃度明顯升高，TAP在各時(shí)間點(diǎn)均明顯上升；淀粉酶峰值前移。結(jié)果表明干擾素γ能促進(jìn)胰蛋白酶原的激活，并加重急性胰腺炎時(shí)的炎癥反應(yīng)與胰腺損傷。 6．急性胰腺炎時(shí)干擾素γ可能通過(guò)Ⅲ型PI3K通路來(lái)誘導(dǎo)自噬和加重炎癥 qRT-PCR顯示干擾素γ組Ⅲ型PI3K復(fù)合物（vps34）mRNA明顯高于急性胰腺炎對(duì)照組，提示急性胰腺炎時(shí)干擾素γ可能通過(guò)該通路誘導(dǎo)自噬和加重胰腺損傷和炎癥。 結(jié)論 急性胰腺炎可誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生，自噬促進(jìn)胰蛋白酶原的激活，并參與胰腺的損傷；急性胰腺炎時(shí)給予干擾素γ可進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，促進(jìn)胰蛋白酶原的活化和加重胰腺的損傷，該效應(yīng)可能通過(guò)Ⅲ型PI3K通路實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R576
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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10 龔經(jīng)文;[N];家庭醫(yī)生報(bào);2007年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊斌;T、B淋巴細(xì)胞對(duì)急性胰腺炎的作用及其免疫治療[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 徐浩銅;急性胰腺炎伴胰周積液向胸腔引流通道的影像解剖學(xué)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

3 趙佳正;P物質(zhì)和硫化氫在評(píng)價(jià)急性胰腺炎嚴(yán)重程度中的作用[D];中南大學(xué);2012年

4 羅雙靈;急性胰腺炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體9mRNA的表達(dá)研究[D];中南大學(xué);2013年

5 陳辰;羅格列酮對(duì)大鼠急性胰腺炎肺損傷的作用及其機(jī)制探討[D];武漢大學(xué);2009年

6 李永文;急性胰腺炎患者血清中miR-216a的表達(dá)及其臨床意義的研究[D];中南大學(xué);2012年

7 楊淑麗;自噬在大鼠急性壞死性胰腺炎中的作用及調(diào)控機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2012年

8 梁垚;降鈣素原和sTREM-1對(duì)急性胰腺炎嚴(yán)重程度的早期預(yù)測(cè)價(jià)值[D];中南大學(xué);2013年

9 李軍成;急性胰腺炎急性期的病變研究[D];蘇州大學(xué);2002年

10 錢祝銀;重癥急性胰腺炎治療的基礎(chǔ)和臨床研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2002年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉堯;胰蛋白酶原激活肽與高遷徙率族蛋白1在急性胰腺炎大鼠模型中的表達(dá)及意義[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2010年

2 崔玉順;延邊地區(qū)603例急性胰腺炎病因及預(yù)后危險(xiǎn)因素的調(diào)查分析[D];延邊大學(xué);2010年

3 江志俊;急性胰腺炎病情嚴(yán)重程度與預(yù)后的早期評(píng)估指標(biāo)探討[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

4 尹朝;BISAP對(duì)急性胰腺炎預(yù)后的評(píng)估價(jià)值[D];山東大學(xué);2010年

5 郭潔;三種評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)急性胰腺炎病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估的比較[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

6 程勇;大鼠急性胰腺炎細(xì)胞凋亡異常及Fas/FasL系統(tǒng)表達(dá)的研究[D];武漢大學(xué);2004年

7 祁高亮;75例急性胰腺炎的臨床證治回顧性研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2010年

8 汪國(guó)宴;MSCT評(píng)價(jià)急性胰腺炎病變程度與肝損傷的相關(guān)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

9 賀麗;急性胰腺炎患者血清IL-15、IL-18和sTNF-1R的變化及其意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2002年

10 崔志剛;急性胰腺炎發(fā)病特點(diǎn)及嚴(yán)重程度預(yù)測(cè)指標(biāo)的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

  本文關(guān)鍵詞：急性胰腺炎時(shí)自噬變化的意義及干擾素γ對(duì)自噬影響的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：184221