本文關(guān)鍵詞：急性胰腺炎時自噬變化的意義及干擾素γ對自噬影響的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第二軍醫(yī)大學(xué)》 2013年

急性胰腺炎時自噬變化的意義及干擾素γ對自噬影響的實驗研究

劉曉  

【摘要】：研究背景 急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床常見的急癥，國外報告其發(fā)病率10/105～44/105，近年來呈升高趨勢。約20%患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎，病死率高達15%～30%，病情危重，預(yù)后兇險，已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的重要殺手。盡管國內(nèi)外學(xué)者對急性胰腺炎的防治進行了多年的研究，但迄今還沒有針對急性胰腺炎特效的防治措施。因此，深入研究AP的發(fā)病機制，探索其啟動的關(guān)鍵過程，不僅具有重要的學(xué)術(shù)價值，而且將有助于尋找和建立有針對性的救治方法，以期提高急性胰腺炎的救治水平，具有重要的的意義。 自噬是廣泛存在于真核生物中的生命現(xiàn)象，屬程序性細(xì)胞死亡的一種。自噬發(fā)生時，在細(xì)胞內(nèi)形成“雙層膜”結(jié)構(gòu)的囊泡即自噬體，包裹胞質(zhì)成分和某些細(xì)胞器碎片，送入溶酶體中并進行多種酶的消化及降解，為細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)提供能量和小分子物質(zhì)。自噬是急性胰腺炎早期發(fā)生的事件，在急性胰腺炎中的作用機制存在很多爭議。有學(xué)者采用敲除自噬相關(guān)基因小鼠研究后發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎減輕，同時自噬相關(guān)蛋白減少，推測自噬在急性胰腺炎中被誘導(dǎo)增強，自噬對胰腺起損害作用；有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎中長壽蛋白的降解大大減少（長壽蛋白通過自噬途徑降解），大量空泡聚集，認(rèn)為自噬在急性胰腺炎中下降，自噬對胰腺起保護作用；另外有學(xué)者認(rèn)為自噬是一個動態(tài)的過程，自噬過程在急性胰腺炎中被破壞，自噬和胰腺炎起相互促進作用。這些相互矛盾結(jié)果顯示自噬在急性胰腺炎發(fā)生中存在很大的爭議。 干擾素γ是一種來自T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清的蛋白，，具有免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞增殖作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)干擾素γ可促進自噬。另有文獻報告干擾素γ對急性胰腺炎有一定影響。為了進一步探討自噬在急性胰腺炎發(fā)生過程中的變化及其病理意義，并觀察干擾素γ對急性胰腺炎及自噬的影響，并探討其作用機制，擬開展本實驗研究。 研究目標(biāo) 1.建立大鼠重癥急性胰腺炎模型。觀察急性胰腺炎發(fā)生過程中自噬活性的變化，探討其病理意義。 2.觀察干擾素γ對急性胰腺炎炎癥及自噬的影響，初步探討其機制。 研究方法圍繞上述目標(biāo)，本研究采用以下研究方法： 1．動物模型的建立 采用左旋精氨酸400mg/100g（腹腔注射，2次，間隔1小時）方法，構(gòu)建急性胰腺炎大鼠模型。 2．電鏡 大鼠新鮮胰腺組織取下后立即置于25%戊二醛電鏡固定液中，切成1mm3大小組織塊，送電鏡室，于透射電鏡下觀察自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。 3．ELISA 造模取血，離心，上清用RD試劑盒行ELISA檢測，檢測不同時間點AMY、TAP的濃度及IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平。 4．HE染色 標(biāo)本置于4％中性緩沖甲醛中固定24小時，組織脫水石蠟包埋，室溫保存，行HE染色后觀察胰腺炎癥程度。 5．免疫組化 經(jīng)漂洗，封閉，一抗和二抗孵育后檢測LC3、Beclin-1、Lamp-2等蛋白在胰腺組織中的表達。 6．Western Blot 經(jīng)過提取蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記一抗和二抗、曝光等步驟觀察LC3、Beclin-1、Lamp-2、GAPDH等蛋白的表達。 7. qRT-PCR 通過RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的方法檢測胰腺組織LC3、Beclin-1、Lamp-2、Ⅲ型PI3K、GAPDH等蛋白的基因表達。 8．統(tǒng)計學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)通過SPSS11.5統(tǒng)計軟件X進行分析，取P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示；兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時采用LSD-t或SNK-q檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3或Dunnett's C檢驗。 研究結(jié)果 1．20%L-精氨酸腹腔注射可構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型 先后采用250mg/100g、300mg/100g、400mg/100g和500mg/100g等不同給藥劑量的20%L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建重癥急性胰腺炎大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)400mg/100g的劑量腹腔注射2次，間隔1小時造模，可成功建立重癥急性胰腺炎大鼠模型。 2．急性胰腺炎誘導(dǎo)增強自噬的發(fā)生 免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，大鼠急性胰腺炎模型組自噬相關(guān)因子LC3、Beclin-1的蛋白與mRNA表達顯著上調(diào)；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎組大鼠胰腺組織自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)明顯多于對照組。結(jié)果證實急性胰腺炎可誘導(dǎo)增強自噬的發(fā)生。 3．調(diào)控自噬可影響胰蛋白酶原的活化程度和急性胰腺炎的損傷程度 分別采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（RAP）和自噬阻斷劑氯喹（CQ）及3-甲基腺嘌呤（3-MA）調(diào)控自噬活性，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬后TAP明顯升高，阻斷自噬后TAP下降；SAP9h后誘導(dǎo)劑組大鼠胰腺壞死病理評分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組與急性胰腺炎組無明顯差別，24h后誘導(dǎo)劑組胰腺壞死評分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組胰腺壞死評分低于急性胰腺炎組。結(jié)果表明急性胰腺炎時自噬可促進胰蛋白酶原的激活，并參與胰腺的損傷。 4．干擾素γ在急性胰腺炎時可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生及自噬體和溶酶體的融合 與急性胰腺炎對照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ，免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測均表明自噬相關(guān)因子LC3及Beclin-1的蛋白和mRNA表達明顯上調(diào)；溶酶體相關(guān)膜蛋白-2（Lamp-2）蛋白和基因表達亦明顯上調(diào)。結(jié)果表明干擾素γ可進一步誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并促進自噬體和溶酶體的融合。 5．干擾素γ能促進胰蛋白酶原的激活和加重急性胰腺炎時胰腺的損傷 與急性胰腺炎對照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ后胰腺水腫、炎癥、壞死、出血評分明顯增高；血漿炎癥因子IL-6濃度明顯升高，TAP在各時間點均明顯上升；淀粉酶峰值前移。結(jié)果表明干擾素γ能促進胰蛋白酶原的激活，并加重急性胰腺炎時的炎癥反應(yīng)與胰腺損傷。 6．急性胰腺炎時干擾素γ可能通過Ⅲ型PI3K通路來誘導(dǎo)自噬和加重炎癥 qRT-PCR顯示干擾素γ組Ⅲ型PI3K復(fù)合物（vps34）mRNA明顯高于急性胰腺炎對照組，提示急性胰腺炎時干擾素γ可能通過該通路誘導(dǎo)自噬和加重胰腺損傷和炎癥。 結(jié)論 急性胰腺炎可誘導(dǎo)增強自噬的發(fā)生，自噬促進胰蛋白酶原的激活，并參與胰腺的損傷；急性胰腺炎時給予干擾素γ可進一步誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，促進胰蛋白酶原的活化和加重胰腺的損傷，該效應(yīng)可能通過Ⅲ型PI3K通路實現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R576
【目錄】：

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本文編號：184221