本文關(guān)鍵詞：Neuritin重組腺相關(guān)病毒2修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)的作用及機制

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【摘要】：目的:視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分,由于其特殊的解剖生理特性成為研究中樞神經(jīng)損傷和再生的理想部位。研究視神經(jīng)損傷后的再生,不僅對視神經(jīng)損傷的治療,同時也對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷后的治療及功能恢復(fù)有著重要的意義。臨床上治療視神經(jīng)損傷的方法主要有藥物治療、視神經(jīng)管減壓手術(shù)、電針和針灸等,但受損神經(jīng)難以再生。視神經(jīng)損傷后會引起視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(RGCs)的逐漸凋亡、內(nèi)在再生能力低下及軸突的再生抑制性微環(huán)境等問題。目前促進受損視神經(jīng)再生的方法主要有:周圍神經(jīng)移植、細(xì)胞移植、添加神經(jīng)營養(yǎng)因子和基因治療等;找準(zhǔn)靶分子,應(yīng)用基因治療視神經(jīng)損傷是近年來研究的熱點,極富應(yīng)用前景。重組腺相關(guān)病毒2(AAV2)是用于眼部最安全、合適的載體,且研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突起素(Neuritin,Nrn1)具有獨特的神經(jīng)營養(yǎng)作用。本課題采用大鼠的視神經(jīng)壓榨傷模型,以Nrn1為靶分子,研究Nrn1對視神經(jīng)損傷后RGCs存活和軸突再生的作用及機制。方法:(1)構(gòu)建Neuritin重組腺相關(guān)病毒2質(zhì)粒并包裝測定其滴度。(2)玻璃體注射及視神經(jīng)壓榨傷模型制作:用微量注射器吸取按照每只眼球2μl的rAAV2-EGFP、rAAV2-Nrn1-EGFP或者生理鹽水注射到大鼠的玻璃體腔,4周后用Yasargil動脈瘤夾在大鼠視神經(jīng)眼球后2mm處夾傷9s,2周后經(jīng)心臟灌注取材。(3)采用免疫熒光組織化學(xué)檢測rAAV2在視網(wǎng)膜中轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型以及轉(zhuǎn)染RGCs的效率。(4)采用Real-timePCR和Westernblot檢測Nrn1在各組視網(wǎng)膜中mRNA和蛋白的表達變化。(5)采用HE染色、免疫組織化學(xué)、CTB追蹤和TUNEL檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對RGCs存活、凋亡的作用。(6)采用RITC標(biāo)記和透射電鏡檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對視神經(jīng)軸突再生的作用。(7)采用瞳孔對光反射和閃光視覺誘發(fā)電位檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對視覺功能恢復(fù)的作用。(8)采用Westernblot檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子pAkt1、pAkt2、pErk1/2和pStat3表達的作用,同時檢測對細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Bcl-2和Bax、Caspase3和CleavedCaspase3表達的作用。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建Neuritin重組腺相關(guān)病毒2的質(zhì)粒,測得的rAAV2-EGFP病毒滴度為2.24×1012vg/ml,rAAV2-Nrn1-EGFP病毒滴度為2.34×1012vg/ml。(2)成功注射Neuritin重組腺相關(guān)病毒2,4周后視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示視網(wǎng)膜大部分細(xì)胞和神經(jīng)纖維表達綠色熒光;免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示rAAV2-EGFP轉(zhuǎn)染約70%的RGCs,且?guī)缀醪晦D(zhuǎn)染RGCs層的星形膠質(zhì)細(xì)胞。(3)成功在視網(wǎng)膜內(nèi)過表達Nrn1,Real-timePCR和Westernblot結(jié)果顯示rAAV2-Nrn1-EGFP組中Nrn1mRNA和蛋白含量分別約為rAAV2-EGFP組的19倍和2.3倍;ONC/rAAV2-Nrn1-EGFP組Nrn1mRNA和蛋白含量分別約為ONC/rAAV2-EGFP組的6倍和2倍。(4)視網(wǎng)膜Nrn1過表達對RGCs存活、視神經(jīng)軸突再生和視覺功能恢復(fù)的作用:HE染色結(jié)果顯示RGCs層細(xì)胞存活數(shù)量增多,gammasynuclein免疫組織化學(xué)和CTB追蹤結(jié)果顯示RGCs的存活數(shù)量增加,TUNEL檢測結(jié)果顯示RGCs層的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少;RITC標(biāo)記視神經(jīng)結(jié)果顯示存留和再生的軸突顯著增加,透射電鏡結(jié)果顯示大部分軸突的髓鞘板層保持緊致,少許稍有松散和變寬;瞳孔對光反射結(jié)果顯示瞳孔從最大縮小至最小時直徑的比值明顯減小,閃光視覺誘發(fā)電位結(jié)果顯示P波的潛伏期時間縮短、振幅增強。(5)視網(wǎng)膜Nrn1過表達對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子表達的作用:Westernblot結(jié)果顯示同時上調(diào)pAkt1和pStat3表達,而對pAkt2和pErk1/2均無明顯作用。視網(wǎng)膜Nrn1過表達對細(xì)胞存活相關(guān)分子表達的作用:Westernblot結(jié)果顯示視網(wǎng)膜中Bcl-2表達上調(diào)、Bax表達下調(diào),Caspase3和CleavedCaspase3表達下調(diào)。結(jié)論:(1)玻璃體注射rAAV2-EGFP后,主要轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜中約70%的RGCs,幾乎不轉(zhuǎn)染RGCs層的星形膠質(zhì)細(xì)胞。(2)玻璃體注射rAAV2-Nrn1-EGFP后,Nrn1在視網(wǎng)膜內(nèi)過表達。(3)視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中過表達Nrn1,可激活A(yù)kt1和Stat3通路,進而抑制線粒體凋亡通路,保護RGCs存活、促進視神經(jīng)軸突再生及視覺功能恢復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：neuritin 視神經(jīng) 損傷 基因治療 視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R774.6
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-16
• 一、視神經(jīng)損傷及治療13
• 二、視神經(jīng)損傷的基因治療13-16
• 實驗材料及方法16-33
• 一、實驗材料16-18
• （一）重組腺相關(guān)病毒2載體、細(xì)胞株和菌株16
• （二）實驗動物16
• （三）主要試劑16-17
• （四）主要設(shè)備17-18
• （五）主要溶液的配置18
• 二、實驗方法18-33
• （一）Neuritin重組腺相關(guān)病毒2的構(gòu)建18-24
• （二）大鼠玻璃體腔注射24
• （三）動物實驗的分組及實驗流程24
• （四）大鼠視神經(jīng)壓榨傷模型的制作24-25
• （五）玻璃體注射FITC-CTB及RITC25
• （六）動物標(biāo)本的固定取材25
• （七）視網(wǎng)膜鋪片及RGCs計數(shù)25
• （八）眼球的石蠟切片25-26
• （九）眼球及視神經(jīng)的冷凍切片26
• （十）免疫熒光組織化學(xué)26
• （十一）實時熒光定量PCR26-28
• （十二）免疫印跡法（Western blot）28-29
• （十三）伊紅-蘇木素（HE）染色29-30
• （十四）免疫組織化學(xué)30
• （十五）細(xì)胞凋亡（TUNEL）檢測30-31
• （十六）透射電子顯微鏡觀察31
• （十七）瞳孔對光反射31
• （十八）閃光視覺誘發(fā)電位31-32
• （十九）統(tǒng)計學(xué)方法分析32-33
• 實驗結(jié)果33-61
• 一、成功構(gòu)建Neuritin重組腺相關(guān)病毒2質(zhì)粒33-34
• 二、Neuritin重組腺相關(guān)病毒2的包裝34-36
• 三、Neuritin重組腺相關(guān)病毒2轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜36-38
• 四、轉(zhuǎn)染后Neuritin在視網(wǎng)膜中的過表達38-41
• 五、Neuritin過表達對受損視神經(jīng)及其RGCs的作用41-54
• 六、Neuritin過表達對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子表達的作用54-58
• 七、Neuritin過表達對細(xì)胞存活相關(guān)分子表達的作用58-61
• 討論61-68
• 一、視神經(jīng)損傷基因治療中轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜的病毒載體61-62
• 二、Neuritin對大鼠受損視神經(jīng)的修復(fù)作用62-64
• （一）Neuritin在神經(jīng)發(fā)育中的作用62-63
• （二）Neuritin在神經(jīng)損傷中的表達變化及作用63
• （三）Neuritin保護受損視神經(jīng)的RGCs63
• （四）Neuritin促進受損視神經(jīng)再生63-64
• 三、Neuritin保護RGCs存活的作用機制64-66
• （一）Neuritin結(jié)合胰島素受體發(fā)揮作用64
• （二）Neuritin激活A(yù)kt1、Stat3通路64-65
• （三）Neuritin抑制經(jīng)線粒體細(xì)胞凋亡通路65-66
• 四、Neuritin促進視神經(jīng)再生的作用機制66-68
• 附錄68-71
• 參考文獻71-76
• 全文小結(jié)76-77
• 創(chuàng)新點和意義77-78
• 在校期間發(fā)表的論文78-79
• 綜述79-89
• 參考文獻86-89
• 致謝89

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Akintomide Apara;Jeffrey L.Goldberg;;Molecular mechanisms of the suppression of axon regeneration by KLF transcription factors[J];Neural Regeneration Research;2014年15期

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本文編號：631743