本文關(guān)鍵詞：miR-744在鼻咽癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方省份及東南亞地區(qū)高發(fā)的一種起源于鼻咽粘膜的鱗狀上皮細(xì)胞腫瘤,尤以廣東、廣西、湖南、福建等地多見(jiàn)。放射治療是公認(rèn)的鼻咽癌主要治療手段。隨著放療技術(shù)的不斷提高,早期患者的5年總體生存率可高達(dá)90%以上。但是,由于鼻咽部比較隱蔽,且早期患者癥狀不明顯,多數(shù)患者于就診時(shí)已屬中晚期。此外,絕大多數(shù)鼻咽癌的病理類型為非角化性未分化型癌,惡性程度較高,具有極強(qiáng)的侵襲能力,極易出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,故中晚期患者的平均5年生存率仍然徘徊在70%左右,治療失敗的主要原因包括局部復(fù)發(fā)(高達(dá)24-42%)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(高達(dá)37-48%),而一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者的中位生存期不超過(guò)1年。因此,探究鼻咽癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,探尋新的干預(yù)靶點(diǎn),對(duì)提高鼻咽癌的治愈率和生存率,延長(zhǎng)患者生命有著極其重要的臨床指導(dǎo)意義。鼻咽癌的發(fā)病具有種族易感性、地域集中性和家族聚集傾向,且與EB病毒感染、遺傳易感性以及環(huán)境因素密切相關(guān),其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜過(guò)程,涉及多個(gè)基因在不同時(shí)間和空間上的選擇性表達(dá)。除了蛋白編碼基因,近年研究發(fā)現(xiàn)microRNA(亦作miRNA或miR)與鼻咽癌有著密切聯(lián)系,影響了腫瘤的治療和預(yù)后。microRNA是一種內(nèi)源性長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA小分子,其序列在不同物種間具有高度保守性,是調(diào)控基因表達(dá)的重要分子。microRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式可以與靶基因的3'UTR區(qū)域結(jié)合,降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá),從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移,例如,miR-26a在鼻咽癌中低表達(dá),其通過(guò)直接靶向EZH2,使細(xì)胞阻滯于G1期,從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖；EB病毒編碼的microRNA miR-BART9可直接靶向E-鈣粘蛋白,從而促進(jìn)EB病毒陽(yáng)性鼻咽癌細(xì)胞的侵襲遷移。同時(shí),有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNA也可以與靶基因的5'UTR、編碼區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)或基因的下游序列相結(jié)合,從而促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá),這些研究表明microRNA的作用方式具有多樣性,例如,miR-324-3p在鼻咽癌組織及放療抵抗的CNE2細(xì)胞中低表達(dá),其通過(guò)直接靶向作用于WNT2B的5'UTR,從而增加鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。此外,microRNA具有在石蠟標(biāo)本、外周血及尿液等多種標(biāo)本中長(zhǎng)期存在的穩(wěn)定性,且血清或血漿中游離的microRNA亦可作為鼻咽癌診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物。由此可見(jiàn),microRNA在作為腫瘤標(biāo)志物以及腫瘤治療靶點(diǎn)方面展示出巨大的潛能,有可能應(yīng)用于鼻咽癌診斷、分子分型、放化療療效預(yù)測(cè)以及預(yù)后判斷等方面。miR-744是本課題組在前期研究中基于芯片技術(shù)篩選腫瘤相關(guān)基因MTA干擾后差異表達(dá)microRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤相關(guān)基因,關(guān)于它的功能學(xué)研究甚少。Cheah Yoke-Kqueen等曾報(bào)道,通過(guò)microRNA芯片技術(shù),他們發(fā)現(xiàn)miR-744在頭頸腫瘤中高表達(dá),表明miR-744在頭頸腫瘤中可能是一個(gè)促癌基因。然而,miR-744定位于17p12,該區(qū)域在侵襲性二倍體乳腺癌、散發(fā)胃癌、侵襲性肺小腺癌及原發(fā)耐藥的霍奇金淋巴瘤中常出現(xiàn)缺失,即miR-744可能是一個(gè)抑癌基因。然而,在對(duì)小鼠前列腺癌的研究中卻得出了與之相反的結(jié)論。Vera Huang等曾報(bào)道,短期過(guò)表達(dá)miR-744可誘導(dǎo)Cyclin B1 (Ccnbl)的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖,而長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)可引起染色體的不穩(wěn)定性并導(dǎo)致腫瘤抑制。然而,miR-744在鼻咽癌中的表達(dá)水平、其表達(dá)在鼻咽癌中的臨床意義及其在鼻咽癌中的生物學(xué)功能,尤其是在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移方面,還未曾報(bào)道。那么miR-744在鼻咽癌中表達(dá)如何,其在鼻咽癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中起著怎樣的作用,作用機(jī)制又是什么,這一系列問(wèn)題都需要我們?nèi)ド钊胩接�。基于miR-744的研究現(xiàn)狀,本課題首先通過(guò)熒光定量PCR技術(shù),明確miR-744在鼻咽癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平,接著通過(guò)miR-744表達(dá)失調(diào)的體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn),探討miR-744在鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,最后通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)及功能回復(fù)實(shí)驗(yàn),闡明miR-744在鼻咽癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制,為進(jìn)一步尋找新的鼻咽癌治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。材料和方法1.臨床標(biāo)本、細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)10例鼻咽癌組織和9例正常鼻咽上皮組織均來(lái)源于南方醫(yī)院。44例鼻咽癌組織的cDNA由李欣教授惠贈(zèng),其中11例和8例cDNA僅分別用于microRNA和mRNA表達(dá)的檢測(cè),其余33例既可用于檢測(cè)microRNA的表達(dá),也可用于檢測(cè)mRNA的表達(dá)。組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)HE染色組織學(xué)檢查確認(rèn)。本研究獲得南方醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有鼻咽癌患者均簽署知情同意書。人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1、CNE1、 CNE2、C666-1、6-10B和5-8F以及人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP-69由南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所保存。6種鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,NP-69細(xì)胞培養(yǎng)于KSFM培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-744前體序列由GeneChem公司合成并插入GV209載體中,構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-744的慢病毒載體,名為L(zhǎng)V-miR-744。含無(wú)關(guān)序列的載體為對(duì)照。將慢病毒轉(zhuǎn)入5-8F細(xì)胞中并經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選及qRT-PCR驗(yàn)證后獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-744細(xì)胞株。3.質(zhì)粒和寡核苷酸構(gòu)建及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-744-inhibitor、nonspecific miR control (anti-NC)、miR-744 mimic和 negative control (mimic-NC)由Genepharma合成。AntagomiR-744、antagoNC、 si-ARHGAP5及其對(duì)照購(gòu)自RiboBio公司。pGL3-ARHGAP5 A/B/C由華安平康公司構(gòu)建；pGL3-control vector及pRL-TK購(gòu)自Promega公司。ARHGAP5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照購(gòu)自廣州復(fù)能公司。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM 2000說(shuō)明書進(jìn)行操作,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。4.RNA抽提及熒光定量PCR從鼻咽癌細(xì)胞和組織中抽提總RNA后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,根據(jù)SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR,以2-△△Ct表示基因的相對(duì)表達(dá)水平。5.細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)[1]MTT實(shí)驗(yàn)：按3×103細(xì)胞/孔將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種至96孔板中,200 μ l/孔,6孔/組,包含空白對(duì)照,培養(yǎng)1-4天。將5mg/ml的MTT 20 μ 1分別加入每孔中,37℃培養(yǎng)4h,將孔內(nèi)培養(yǎng)基輕輕吸棄,加入DMSO 150μl,室溫?fù)u床輕搖10min使結(jié)晶物溶解充分,于酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm波長(zhǎng)的吸光度值,用來(lái)表示細(xì)胞的增殖能力。[2]平板克隆實(shí)驗(yàn)：按200細(xì)胞/孔將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種至6孔板中,2m1/孔,充分混勻,培養(yǎng)14天。肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基,經(jīng)甲醇固定、蘇木素染色及蒸餾水清洗后,顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)(一個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)≥50)。[3]Edu細(xì)胞增殖檢測(cè)：按照Cell-LightTM Edu檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)Edu孵育、4%多聚甲醛固定、甘氨酸洗脫、Apollo染液染色及PBS清洗后于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)Edu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。[4]細(xì)胞凋亡檢測(cè)：按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)不含EDTA胰酶消化、PBS清洗、Annexin V-FITC及PI染色后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。[5]劃痕實(shí)驗(yàn)：待細(xì)胞轉(zhuǎn)染后融合度為90%時(shí),用20μl加樣槍頭制造一“十”字樣劃痕,經(jīng)PBS清洗、更換無(wú)血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng),并于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移率。[6]遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、PBS清洗及無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù),按1×105細(xì)胞/室將細(xì)胞加入Transwell小室內(nèi),100μl/室,室外浸于新鮮培養(yǎng)基中。待培養(yǎng)12-36h后經(jīng)棉簽擦拭、甲醇固定、蘇木素染色及蒸餾水清洗后,于顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜生長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)。6.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-744的5-8F/miR-744和對(duì)照組5-8F/control分別接種于8只裸鼠的左、右側(cè)后背部皮下,2×106細(xì)胞/只,8只/組。第七天開(kāi)始每三天用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)短徑一次,按下述公式計(jì)算腫瘤體積：v=(L×W2)/2,其中,L為腫瘤最長(zhǎng)徑(mm),W為腫瘤最短徑(mm)。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將裸鼠處死,取出腫瘤組織,經(jīng)福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋、切片及HE染色后,光學(xué)顯微鏡觀察。7.裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h后的5-8F/AntagomiR-744和對(duì)照組5-8F/AntagoNC分別注射入裸鼠尾靜脈中,2×106細(xì)胞/只,7只/組。30天后將裸鼠處死,取出肺組織,經(jīng)福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋、切片及HE染色后,光學(xué)顯微鏡觀察,計(jì)算肺轉(zhuǎn)移指數(shù)：轉(zhuǎn)移瘤面積/全肺面積。8.雙熒光素酶活性檢測(cè)按照Dual-Luciferase(?) Reporter Assay System說(shuō)明書操作,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞充分裂解,于GloMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光儀上分別測(cè)定Firefly luciferase和Renilla luciferase的活性,以pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參,計(jì)算上述兩熒光素酶活性的比值,比較不同樣品間的差異。9. Western blot按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,然后經(jīng)蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫雜交、顯影后,采用Quantity One軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)相對(duì)定量。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。qRT-PCR各細(xì)胞株2-△△ct比較采用Brown-Forsythe法；MTT生長(zhǎng)曲線比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)中兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。miR-744與ARHGAP5表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman目關(guān)系數(shù)。所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,數(shù)值大小以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.miR-744在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義qRT-PCR結(jié)果顯示,與NP-69相比,miR-744在6種鼻咽癌細(xì)胞株中呈不同程度表達(dá)上調(diào)(F=22.5320,P=0.0005)；在10例鼻咽癌組織中,miR-744的平均表達(dá)水平比9例正常鼻咽上皮組織提高62%(P=0.045)。44例鼻咽癌組織中,miR-744的表達(dá)與鼻咽癌的臨床分期(t=-3.0501,P=0.0040)、N分期(t=-2.6144,P=0.0124)及T分期(t=-2.3568,P=0.0232)呈正相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-744在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),且與鼻咽癌的疾病進(jìn)展呈正相關(guān),表明miR-744可能是一個(gè)促癌基因,為其生物學(xué)功能研究提供了初步依據(jù)。2.miR-744在鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究選取人鼻咽癌細(xì)胞株SUNE-1的高轉(zhuǎn)移亞株5-8F及低分化鼻咽癌細(xì)胞株HONE1作為細(xì)胞模型,通過(guò)miR-744表達(dá)失調(diào)的體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn),研究miR-744在鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。首先,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-744 mimic和inhibitor, qRT-PCR檢測(cè)miR-744的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在5-8F及HONE1中轉(zhuǎn)染miR-744mimic后,miR-744的表達(dá)分別提高了440倍(t=-41.5763,P=0.0000)和282倍(t=14.2170,P=0.0000)；而轉(zhuǎn)染miR-744 inhibitor后,miR-744的表達(dá)分別降低74%(t=-35.5825,P=0.0001)和95%(t=115.6971,P=0.0000)。該結(jié)果表示,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-744 mimic和inhibit or后可顯著上調(diào)或下調(diào)miR-744的表達(dá)。其次,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)觀察miR-744表達(dá)改變對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-744 mimic后,5-8F及HONE1的遷移率分別提高了1.46倍(t=-6.0498,P=0.0038)和1.65倍(t=6.9631,P=0.0001)；而轉(zhuǎn)染miR-744 inhibitor后,兩種細(xì)胞的遷移率分別降低了36%(t=-13.9914,P=0.0022)和31%(t=4.1427,P=0.0143)。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-744過(guò)表達(dá)使5-8F及HONE1的遷移細(xì)胞數(shù)分別提高了2.48倍(t=-21.2596,P=0.0000)和2.27倍(t==7.1178,P=0.0021),侵襲細(xì)胞數(shù)分別提高了3.14倍(t=-21.0958,P=0.0000)和2.43倍(t=-9.2698,P=0.0008)；而miR-744低表達(dá)使兩種細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)分別降低了58%(t=6.2225,P=0.0034)和77%(t=5.8897,P=0.0042),侵襲細(xì)胞數(shù)分別降低了59%(t=5.9699,P=0.0040)和64%(t=3.5335,P=0.0242)。在此結(jié)果基礎(chǔ)上,構(gòu)建持續(xù)干擾miR-744的細(xì)胞株5-8F/AntagomiR-744及5-8F/AntagoNC,經(jīng)過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),AntagomiR-744可持續(xù)干擾miR-744使其表達(dá)降低超過(guò)50%至少15天,遂將5-8F/AntagomiR-744及5-8F/AntagoNC分別注射入裸鼠尾靜脈中,建立裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型,進(jìn)一步研究干擾miR-744對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果表明,對(duì)照組肺轉(zhuǎn)移瘤大且數(shù)量較多,而實(shí)驗(yàn)組肺轉(zhuǎn)移瘤小且數(shù)量較少,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組的肺轉(zhuǎn)移指數(shù)明顯降低81%(t=2.7938,P=0.0296)。最后,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Edu細(xì)胞增殖檢測(cè)及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)觀察miR-744表達(dá)改變對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響。MTT結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-744 mimic后,5-8F和HONE1細(xì)胞生長(zhǎng)加快(P=0.0000,0.0000)；而轉(zhuǎn)染miR-744 inhibitor后,兩種細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢(P=0.0009,0.0008)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,miR-744過(guò)表達(dá)使5-8F和HONEl的克隆形成率分別提高了1.47倍(t=-9.7502,P=0.0006)和1.61倍(t=5.1920,P=0.0066)；而miR-744低表達(dá)使兩種細(xì)胞的克隆形成率分別降低了34%(t=7.9394,P=0.0014)和26%(t=-10.3020,P=0.0005)。Edu細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-744 mimic后,5-8F和HONE1中Edu陽(yáng)性細(xì)胞率分別提高了1.24倍(t=-3.9000,P--0.0175)和1.50倍(t=-4.7213,P=0.0092)；而轉(zhuǎn)染miR-744 inhibitor后,兩種細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞率分別降低了30%(t=4.2548,P=0.0131)和46%(t=5.9850,P=0.0039)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示,miR-744過(guò)表達(dá)使5-8F和HONE1的細(xì)胞凋亡率分別降低了24%(t=3.5496,P=0.0238)和40%(t=4.4922,P=0.0109)；而miR-744低表達(dá)使兩種細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別提高了1.20倍(t=-5.0289,P=0.0073)和1.54倍(t=-3.1292,P=0.0352)。在此結(jié)果基礎(chǔ)上,將慢病毒轉(zhuǎn)入5-8F細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-744的細(xì)胞株5-8F/miR-744及5-8F/control,經(jīng)過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-744的表達(dá)提高了3.32倍(t=33.9602,P=0.0000)。遂將5-8F/miR-744及5-8F/control接種至裸鼠皮下,建立裸鼠皮下成瘤模型,進(jìn)一步研究miR-744過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果表明,接種后第10天成瘤能力開(kāi)始出現(xiàn)差異,5-8F/miR-744細(xì)胞所形成的腫瘤體積顯著大于對(duì)照細(xì)胞(t=2.4996,P=0.0383)。至第21天,5-8F/miR-744細(xì)胞所形成的腫瘤體積較對(duì)照細(xì)胞增大2.64倍(t=5.9742,P=0.0000),且腫瘤的平均重量亦較對(duì)照細(xì)胞提高了3.96倍(t=39.1682,P=0.0000)。以上結(jié)果顯示,miR-744參與了鼻咽癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程,其表達(dá)失調(diào)與鼻咽癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在鼻咽癌中起著促癌基因的作用。3.miR-744促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移的相關(guān)分子機(jī)制研究目前,ARHGAP5已被證實(shí)能促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲遷移。通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)miR-744過(guò)表達(dá)或抑制后的鼻咽癌細(xì)胞株5-8F及HONE1中ARHGAP5 mRNA和蛋白的表達(dá)我們發(fā)現(xiàn),miR-744過(guò)表達(dá)后可顯著上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞株中ARHGAP5 mRNA和蛋白的表達(dá),而抑制miR-744后ARHGAP5 mRNA和蛋白的表達(dá)降低。利用TargetScan、miRanda和RNAhybrid三大軟件對(duì)miR-744進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在TargetScan和miRanda兩大數(shù)據(jù)庫(kù)中并未發(fā)現(xiàn)miR-744靶向ARHGAP5 3'UTR的結(jié)合位點(diǎn),而利用RNAhybrid我們發(fā)現(xiàn)miR-744在ARHGAP5的啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)可能結(jié)合位點(diǎn)(site 1,-508至-484；site 2,-200至-176,其中,miR-744的種子序列在site 1中與ARHGAP5連續(xù)完全互補(bǔ)配對(duì))�；谝陨辖Y(jié)果我們推測(cè),ARHGAP5可能是miR-744的靶基因。因此,我們將含有miR-744結(jié)合位點(diǎn)的ARHGAP5的啟動(dòng)子區(qū)克隆到報(bào)告基因載體pGL3中,分別構(gòu)建了3個(gè)載體：ARHGAP5 A(-1006至+238)和ARHGAP5 B(-534至+238)均包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),ARHGAP5 C(-431至+238)只包含site 2。將上述質(zhì)粒和miR-744 mimic、negative control及海腎熒光素酶載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染5-8F及HONE1細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,miR-744 mimic可分別使5-8F及HONE1細(xì)胞中pGL3-ARHGAP5 A的熒光素酶活性提高1.78倍(t=10.8158,P=0.0004)和1.82倍(t-=6.9733,P=0.0022),pGL3-ARHGAP5 B的熒光素酶活性提高2.04倍(t-=18.1219,P=0.0000)和1.81倍(t=16.4906,P=0.0000),但pGL3-ARHGAP5 A與pGL3-ARHGAP5 B的熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而miR-744 mimic對(duì) pGL-ARHGAP5 C的熒光素酶活性無(wú)明顯改變。表明miR-744與ARHGAP5的site 1可特異性結(jié)合�；谝陨辖Y(jié)果,我們分別將si-ARHGAP5及其對(duì)照與miR-744 mimic及negative control進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,通過(guò)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)miR-744能提高ARHGAP5的表達(dá),抑制ARHGAP5能顯著降低其自身的表達(dá),而共轉(zhuǎn)染si-ARHGAP5及miR-744 mimic后,miR-744mimic可部分或完全逆轉(zhuǎn)si-ARHGAP5對(duì)ARHGAP5表達(dá)的影響。此外,我們還進(jìn)行了Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Boyden侵襲實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步從功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-744對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控是通過(guò)ARHGAP5實(shí)現(xiàn)的。最后,我們分別將ARHGAP5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照與miR-744 inhibitor及nonspecific miR control共轉(zhuǎn)染并進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn),結(jié)果與上述結(jié)論相符。然而,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)我們并未發(fā)現(xiàn)ARHGAP5對(duì)miR-744介導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響。4.ARHGAP5在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn),與NP-69相比,URHGAP5的mRNA及蛋白在除C666-1之外的5種鼻咽癌細(xì)胞株中呈不同程度表達(dá)上調(diào)(F=294.2476,P=0.0000),盡管miR-744與ARHGAP5 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān),但相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.7714,P=0.0724)。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)41例鼻咽癌組織中ARHGAP5的表達(dá)我們發(fā)現(xiàn),ARHGAP5的表達(dá)與鼻咽癌臨床分期及N分期呈正相關(guān)(分別為t=-2.4464,P=0.0192；t=-2.4045,P=0.0216),與T分期無(wú)顯著相關(guān)性(t==-1.0882,P=0.2873)。此外,我們將33例鼻咽癌組織中miR-744的表達(dá)與ARHGAP5的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示兩者的表達(dá)呈正相關(guān),且相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.3506,P=0.0455)。結(jié)論1.miR-744在鼻咽癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào),且與鼻咽癌的臨床分期、N分期、T分期呈正相關(guān)。2.miR-744參與了鼻咽癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制,其表達(dá)失調(diào)可影響鼻咽癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖和轉(zhuǎn)移能力,扮演著癌基因的角色。3.在鼻咽癌中,ARHGAP5為miR-744的靶基因,miR-744通過(guò)直接靶向ARHGAP5啟動(dòng)子促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲。4. ARHGAP5在鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào),且與鼻咽癌的臨床分期、N分期呈正相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：miR-744 鼻咽癌 ARHGAP5 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-28
• 前言28-33
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 技術(shù)路線33-34
• 第一章 miR-744在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義34-43
• 1.1 材料與方法34-37
• 1.2 結(jié)果37-40
• 1.3 討論40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 第二章 miR-744在鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究43-60
• 2.1 材料與方法43-48
• 2.2 結(jié)果48-57
• 2.3 討論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-60
• 第三章 miR-744促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移的相關(guān)分子機(jī)制研究60-77
• 3.1 材料與方法60-67
• 3.2 結(jié)果67-73
• 3.3 討論73-75
• 參考文獻(xiàn)75-77
• 第四章 RHGAP5在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義77-82
• 4.1 材料與方法77-78
• 4.2 結(jié)果78-81
• 4.3 討論81
• 參考文獻(xiàn)81-82
• 全文小結(jié)82-83
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文83
• 攻讀學(xué)位期間參與課題83-85
• 中英文縮略詞對(duì)照表85-86
• 致謝86-88

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本文編號(hào)：373525