本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)細胞攝取神經(jīng)干細胞外泌體途徑及其機制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的:視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一組基因介導(dǎo)的神經(jīng)退行性視網(wǎng)膜疾病,目前仍沒有有效的治療手段。干細胞移植是目前最有前景的治療方法之一,但作用機制仍不清楚,干細胞/前體細胞對損傷組織修復(fù)的機制仍存在爭論。過去認(rèn)為干細胞的治療僅僅是通過細胞替代(cell replacement)發(fā)揮作用,但這一治療機制由于僅有少部分在移植后期1-2個月細胞發(fā)生移行、整合而遭到質(zhì)疑。目前研究認(rèn)為旁分泌效應(yīng)(bystander effects)而非僅是細胞替代介導(dǎo)了干細胞的治療作用[1],而干細胞分泌的胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)可能參與了微環(huán)境調(diào)控和改善,從而發(fā)揮部分治療作用。胞外囊泡(EVs)是細胞分泌的納米級膜性囊泡,包含不同類型;主要為外泌體(exosomes,EXOs)、微囊泡(Multi-Vesicles,MVs),它們在細胞間信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前對于這些囊泡的研究仍存在諸多問題和挑戰(zhàn),首先何種囊泡參與調(diào)控宿主細胞及微環(huán)境仍不清楚,其次雖然外泌體和細胞間的相互作用已經(jīng)證實,但是外泌體與目標(biāo)細胞結(jié)合后可能的交流機制仍缺乏廣泛研究。在本課題中,將重點研究:1.小鼠神經(jīng)干細胞胞外囊泡兩種提取方法的比較;2.小鼠神經(jīng)干細胞外泌體在3T3-fGFP細胞和神經(jīng)系統(tǒng)細胞內(nèi)吞中的通路機制。方法:1.用超速離心法獲得胞外囊泡(EV)和Total Exosome Isolation Kit法富集外泌體(EXO);2.形態(tài)學(xué)水平比較兩種樣品(透射電鏡和原子力顯微鏡);3.蛋白水平比較兩種樣品(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡);4.脂質(zhì)染料標(biāo)記超速離心法獲得外泌體;5.3T3-f GFP細胞、原代LE大鼠皮層膠質(zhì)細胞及原代LE大鼠海馬神經(jīng)元對C17.2細胞外泌體攝取方式研究;6.3T3-f GFP細胞、原代LE大鼠皮層膠質(zhì)細胞及大鼠少突膠質(zhì)細胞系oli-neu細胞攝取C17.2細胞外泌體通路機制研究。結(jié)果:一、小鼠神經(jīng)干細胞胞外囊泡兩種提取方法的比較1.c17.2神經(jīng)干細胞生長良好,形態(tài)規(guī)則未出現(xiàn)明顯分化現(xiàn)象,表明所提取囊泡來自小鼠神經(jīng)干細胞所分泌。2.透射電鏡下ev和exo均觀察到圓形雙層膜結(jié)構(gòu)和“杯狀”外形的囊泡,與之前文獻報道一致,直徑分布多集中在300nm以內(nèi),并且發(fā)現(xiàn)胞外囊泡的平均直徑大于外泌體,提示兩種方法提取的樣品中除外泌體還有體積較大的其他類型囊泡。3.原子力顯微鏡結(jié)果顯示,ev和exo的高度分布多集中在2-20nm以內(nèi),直徑分布多集中在300nm以內(nèi),并且外泌體的平均高度和平均直徑均大于胞外囊泡,提示超速方法提取的囊泡中從形態(tài)上分析是外泌體和更小囊泡組成的復(fù)合物,且以外泌體為主。4.sds-page結(jié)果顯示ev和exo所含蛋白種類、表達豐度接近。在相同上樣量下hsp70的表達強度兩者接近,但cd63、cd9和cd81三種蛋白在胞外囊泡中表達更強,從蛋白水平證明超速離心方法提取的胞外囊泡中外泌體含量較高。二、小鼠神經(jīng)干細胞外泌體在3t3-fgfp細胞和神經(jīng)系統(tǒng)細胞中攝取通路研究1.攝取實驗表明3t3-fgfp細胞、大鼠皮層膠質(zhì)細胞和大鼠海馬神經(jīng)元細胞通過Qg吞通路攝取c17.2細胞外泌體,轉(zhuǎn)運到細胞核周圍的區(qū)域,并且Qg吞數(shù)量與時間相關(guān),隨著時間延長而增加。2.這種Qg吞不僅可以發(fā)生在相同種屬來源的小鼠神經(jīng)干細胞與小鼠胚胎成纖維細胞之間,也可發(fā)生在不同種屬來源的小鼠神經(jīng)干細胞與大鼠神經(jīng)系統(tǒng)細胞之間。3.通過藥理實驗確定網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的Qg吞通路為3t3-fgfp細胞、大鼠皮層膠質(zhì)細胞和大鼠少突膠質(zhì)細胞系oli-neu細胞Qg吞c17.2細胞外泌體的重要通路,使用網(wǎng)格蛋白通路抑制劑組Qg吞外泌體的數(shù)量明顯減少。結(jié)論:1、本實驗從形態(tài)學(xué)和蛋白水平證明使用的超速離心方法獲得的胞外囊泡中主要包含外泌體,更加全面的證實該方法是一種簡單、經(jīng)濟的外泌體收集方法。2、本實驗首次發(fā)現(xiàn)c17.2細胞來源的外泌體主要是通過Qg吞通路而非融合方式被3t3-fgfp、le大鼠皮層膠質(zhì)細胞及l(fā)e大鼠海馬神經(jīng)元細胞攝取,且Qg吞數(shù)量的增加呈現(xiàn)時間相關(guān)。并且這種Qg吞不僅可以發(fā)生在相同種屬來源的神經(jīng)干細胞與成纖維細胞之間,也可發(fā)生在不同種屬來源的神經(jīng)干細胞與神經(jīng)系統(tǒng)細胞之間。3、本實驗率先提出了3t3-fgfp細胞、大鼠少突膠質(zhì)細胞系oli-neur及原代le大鼠皮層膠質(zhì)細胞主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的Qg吞通路攝取C17.2細胞外泌體,而脂筏介導(dǎo)的Qg吞通路可能并不是這三種細胞Qg吞的主要通路。
【關(guān)鍵詞】：小鼠神經(jīng)干細胞 外泌體 神經(jīng)細胞 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 小鼠神經(jīng)干細胞胞外囊泡兩種提取方法比較研究17-28
• 2.1 前言17
• 2.2 材料和方法17-21
• 2.3 結(jié)果21-24
• 2.4 討論24-27
• 2.5 小結(jié)27-28
• 第三章 小鼠神經(jīng)干細胞外泌體在 3T3-fGFP細胞和神經(jīng)系統(tǒng)細胞中攝取通路研究28-52
• 前言28-30
• 第一節(jié) 小鼠神經(jīng)干細胞外泌體在 3T3-fGFP細胞和神經(jīng)細胞攝取動力學(xué)研究30-40
• 3.2 材料和方法30-34
• 3.3 結(jié)果34-40
• 第二節(jié) 小鼠神經(jīng)干細胞外泌體在神經(jīng)細胞攝取通路及機制研究40-52
• 3.4 材料和方法40-42
• 3.5 結(jié)果42-49
• 3.6 討論49-51
• 3.7 小結(jié)51-52
• 全文結(jié)論52-53
• 參考文獻53-56
• 文獻綜述 胞外囊泡在神經(jīng)系統(tǒng)中的生理作用和治療應(yīng)用56-66
• 參考文獻63-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊樹源,安沂華;再述神經(jīng)干細胞的研究及其應(yīng)用前景[J];中華神經(jīng)外科雜志;2002年05期

2 黃鎮(zhèn),金國華,徐慧君;神經(jīng)干細胞研究進展[J];解剖科學(xué)進展;2002年01期

3 朱曉峰;神經(jīng)干細胞研究的幾個問題[J];黑龍江醫(yī)藥科學(xué);2002年05期

4 張敬軍,夏作理,劉焯霖;神經(jīng)干細胞的研究[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2002年02期

5 季慶;神經(jīng)干細胞的研究近況[J];醫(yī)學(xué)綜述;2002年05期

6 田玲;;蛋白可促使神經(jīng)干細胞移動[J];國外醫(yī)學(xué)情報;2002年09期

7 張敬軍,劉焯霖;神經(jīng)干細胞的研究[J];中國病理生理雜志;2003年04期

8 張國福,林建華;神經(jīng)干細胞的研究進展[J];福建中醫(yī)藥;2003年03期

9 劉岳文,杜永紅,王可,徐正順;神經(jīng)干細胞的研究進展[J];河南科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2003年02期

10 王任直;張波;竇萬臣;鄭彤;;神經(jīng)干細胞應(yīng)用的理論基礎(chǔ)和策略[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;2003年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王華;王文輝;林蕾;;神經(jīng)干細胞的研究進展及前景展望[A];第六屆西部介入放射學(xué)術(shù)會議寧夏醫(yī)學(xué)會放射學(xué)分會第四屆年會介入放射學(xué)新技術(shù)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2009年

2 戴毅;韓忠朝;;神經(jīng)干細胞研究進展及臨床前景展望[A];中國解剖學(xué)會第八屆組織學(xué)與胚胎學(xué)專業(yè)青年研討會論文集[C];2004年

3 孫一睿;胡錦;王爾松;奚才華;姚海軍;;單層黏附培養(yǎng)技術(shù)在哺乳動物神經(jīng)干細胞體外穩(wěn)定增殖和多向分化中的應(yīng)用[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

4 劉佳梅;;腦內(nèi)皮細胞與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)促進神經(jīng)干細胞的遷移[A];中國解剖學(xué)會第十一屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

5 魏勇;應(yīng)大君;張偉;董世武;;幼齡家豬腦SVZ神經(jīng)干細胞的分離與鑒定[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

6 司銀楚;朱培純;程龍;吳海霞;許紅;;去皮層血管對成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細胞的影響[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

7 李學(xué)坤;郭安臣;左萍萍;;胎鼠海馬神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)、鑒定及亞克隆[A];中國藥理學(xué)會第十屆全國神經(jīng)學(xué)術(shù)會議暨浙江省藥理學(xué)會2002年年會論文摘要集[C];2002年

8 李力;萬琪;;小鼠神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及缺血神經(jīng)元對其增殖、分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

9 李力;萬琪;劉永紅;張巍;;小鼠神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及缺血神經(jīng)元對其增殖、分化的影響[A];科技、工程與經(jīng)濟社會協(xié)調(diào)發(fā)展——中國科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

10 徐群淵;;神經(jīng)干細胞的分離、純化和永生化[A];中國組織工程、干細胞與神經(jīng)再生學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡德榮;“抑制蛋白”可控制神經(jīng)干細胞提前分化[N];健康報;2007年

2 孫國根　白毅;靈長類腦內(nèi)神經(jīng)干細胞被發(fā)現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2011年

3 孫國根;阻礙卒中后神經(jīng)干細胞再生的“元兇”被發(fā)現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2013年

4 ;我國科學(xué)家成功地在體外培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2001年

5 沈麗 付鈺;神奇的神經(jīng)干細胞[N];科技日報;2002年

6 時仲省 高思敏 劉春陽;河南醫(yī)大成功培養(yǎng)人胚神經(jīng)干細胞[N];中國醫(yī)藥報;2001年

7 梓華;神經(jīng)干細胞可治惡性腦癌[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

8 許琦敏;腦損傷修復(fù)治療又有新希望[N];文匯報;2007年

9 北京市神經(jīng)外科研究所 北京天壇醫(yī)院 王忠誠邋院士;神經(jīng)修復(fù)的生力軍——神經(jīng)干細胞[N];健康報;2008年

10 孫國根;神經(jīng)干細胞并非“全能制造者”[N];中國醫(yī)藥報;2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張帆;Miranda磷酸化調(diào)控果蠅神經(jīng)干細胞不對稱分裂的機制[D];浙江大學(xué);2014年

2 郭立云;獼猴胚胎源性神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)、腦內(nèi)移植及其在青光眼玻璃體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸—探索性研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

3 任永娟;材料調(diào)控神經(jīng)干細胞的研究[D];清華大學(xué);2009年

4 曹翠麗;大鼠神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化[D];河北醫(yī)科大學(xué);2005年

5 周虎田;骨髓源神經(jīng)干細胞生物學(xué)特性的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 段發(fā)亮;神經(jīng)干細胞培養(yǎng)、增殖、遷移和分化的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

7 許漢鵬;中樞神經(jīng)系統(tǒng)多潛能神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)模型的建立及其細胞學(xué)特性的初步研究和體內(nèi)移植實驗[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2000年

8 高劍峰;海馬神經(jīng)干細胞增生分化及影響因素[D];鄭州大學(xué);2010年

9 高峰;小鼠神經(jīng)干細胞免疫原性的研究[D];浙江大學(xué);2010年

10 王霞;酒精對胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細胞自我更新和分化的影響研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李武雄;MK-801在谷氨酸-Shh信號通路中的阻斷作用[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2014年

2 馮旭;NeuroD慢病毒載體構(gòu)建及在大鼠神經(jīng)干細胞的過表達[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 閆姍姍;人臍帶間充質(zhì)干細胞重編程為神經(jīng)干細胞的調(diào)控機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 魏維;松果菊苷對神經(jīng)干細胞體外增殖的影響[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

5 周強意;轉(zhuǎn)TrkC神經(jīng)干細胞聯(lián)合膠原支架對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型治療作用的實驗研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

6 孫爽;孕酮對Aβ_(25-35)損傷的神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響及機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 劉磊;神經(jīng)干細胞移植治療大鼠腦梗死的實驗研究[D];鄭州大學(xué);2015年

8 張濤;降鈣素基因相關(guān)肽促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化[D];蘇州大學(xué);2015年

9 楊明;谷氨酸/NMDA1、Shh介導(dǎo)的成體NSC增殖分化信號通路的研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

10 甘小鳳;弓形蟲抑制Wnt/β-catenin通路干擾C17.2神經(jīng)干細胞的分化[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)細胞攝取神經(jīng)干細胞外泌體途徑及其機制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：373164