目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽部粘膜的惡性腫瘤。其起病隱蔽、惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移,嚴重威脅患者的身心健康。大量研究發(fā)現(xiàn)癌基因的過度表達是鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的重要生物因素。近年來,研究發(fā)現(xiàn)細胞分裂周期相關(guān)蛋白2(Cell Devision Cycle Associated 2,CDCA2)在多種腫瘤中表達上調(diào),且其表達上調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有關(guān),但在鼻咽癌中尚未見有報道。本研究主要探討CDCA2在鼻咽癌中的表達情況及其對鼻咽癌細胞生物學功能的影響。方法:1.應用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和免疫組織化學(immunohistochemistry)技術(shù)檢測鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中CDCA2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平,分析CDCA2表達與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系。2.應用蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)檢測鼻咽癌細胞株HK1、HONE1、5-8F、CNE1、CNE2和CNE2Z細胞中CDCA2蛋白的表達,確定用于后續(xù)研究的細胞株。3.利用慢病毒載體介導的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),敲低HK1、HONE1和5-8F細胞株中的CDCA2表達。將載有CDCA2沉默片段的慢病毒分別轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株HK1,HONE1和5-8F,建立實驗組(HK1-shCDCA2,HONE1-shCDCA2,5-8F-shCDCA2)。轉(zhuǎn)染載有空載片段的慢病毒的細胞作為陰性空載組(HK1-shCtrl,HONE1-shCtrl,5-8F-shCtrl),未作處理的細胞為空白對照組(HK1,HONE1,5-8F)。用熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率,用qRT-PCR和WB法分別檢測各組細胞CDCA2 mRNA和蛋白的表達情況,以確定沉默效果。4.采用CCK-8實驗和細胞平板克隆形成實驗來評價沉默CDCA2對HK1、HONE1和5-8F細胞增殖能力的影響。5.應用細胞劃痕實驗、Transwell遷移和Transwell侵襲實驗來檢測CDCA2表達抑制對HK1、HONE1和5-8F細胞遷移及侵襲能力的影響。6.用流式細胞技術(shù)檢測各組細胞的細胞周期和凋亡情況。7.用WB檢測CDCA2是否影響細胞周期相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果:1.16例鼻咽癌組織和16例鼻咽部粘膜慢性炎組織中CDCA2mRNA的相對表達量分別為5.319±3.198,1.148±0.759。相對于鼻咽部粘膜慢性炎組織,鼻咽癌組織中CDCA2 mRNA的相對表達量明顯增高,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。CDCA2蛋白在鼻咽癌組織中表達的陽性率為60.47%(52/86),明顯高于其在鼻咽部粘膜慢性炎組織中表達的陽性率11.76%(6/51),且其表達與腫瘤局部浸潤(P=0.033)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.034)有關(guān)。2.與CNE1、CNE2和CNE2Z相比,HK1、HONE1及5-8F中CDCA2的基礎(chǔ)表達相對較高,因此本研究選擇此3株細胞用于后續(xù)的體外細胞實驗。3.實驗組和陰性空載組的慢病毒轉(zhuǎn)染效率均大于90%;與陰性空載組和空白對照組相比,CDCA2 mRNA和蛋白在實驗組的表達均明顯降低(P0.001),說明成功構(gòu)建了CDCA2沉默鼻咽癌細胞穩(wěn)定株。4.CCK-8實驗顯示,敲低CDCA2表達后,HK1、HONE1以及5-8F細胞48h后的增殖能力顯著降低(P0.05)。平板克隆形成實驗中,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的克隆形成率分別為(63.733±3.859)%、(63.467±4.601)%和(41.133±2.344)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的克隆形成率分別為(44.200±3.143)%、(45.667±2.516)%和(35.200±2.553)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的克隆形成率分別為(64.667±3.113)%、(65.667±2.516)%和(53.267±2.610)%。據(jù)此,CDCA2沉默表達后,鼻咽癌細胞克隆形成能力顯著降低(P0.05)。5.沉默CDCA2表達后,未發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞株HK1、HONE1及5-8F細胞的遷移侵襲能力發(fā)生顯著變化(P0.05)。6.用流式細胞儀檢測細胞周期,實驗結(jié)果顯示HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的G0+G1期細胞比例分別為(62.380±2.868)%、(62.723±1.806)%和(69.507±2.607)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的G0+G1期細胞比例分別為(33.697±1.825)%、(32.603±2.365)%和(45.320±1.360)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的G0+G1期細胞比例分別為(62.050±3.080)%、(62.810±2.440)%和(68.373±2.437)%。實驗組較陰性空載組和空白對照組G0+G1期的細胞數(shù)明顯上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而3株細胞在G2+M期以及S期的變化表現(xiàn)不一。用Annexin V-APC/7-AAD雙染料法檢測細胞凋亡率,實驗結(jié)果顯示敲低CDCA2后,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的總凋亡率分別為(7.303±0.702)%、(7.170±0.310)%和(8.967±0.656)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的總凋亡率分別為(7.040±0.616)%、(6.907±0.708)%和(16.397±1.903)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的總凋亡率分別為(18.570±1.415)%、(17.883±1.734)%和(23.343±2.270)%。鼻咽癌細胞總凋亡率升高,差別有統(tǒng)計意義(P0.05)。7.WB顯示,CDCA2沉默后,細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)和細胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)的表達顯著降低,而細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21蛋白表達顯著增高;細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表達無明顯變化。結(jié)論:1.較鼻咽部粘膜慢性炎組織,CDCA2 mRNA和蛋白在鼻咽癌組織中的表達上調(diào),且其表達上調(diào)可能與腫瘤局部浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。2.CDCA2可能通過影響鼻咽癌細胞中細胞周期蛋白CDK4、CDK6和p21的表達來調(diào)控細胞周期,促進鼻咽癌細胞增殖,同時可能影響細胞凋亡。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

圖 1-1. Real-Time PCR 反應條件Figure 1-1. Real-Time PCR protpcol2.3.2 Real-time PCR 擴增產(chǎn)物特異性的判斷對 Real-time PCR 擴增產(chǎn)物的熔解曲線進行分析，確定 β-actin 引物和CDCA2 引物是否具有特異性以及 PCR 產(chǎn)物是否單一。若熔解曲線呈特異性單一溶解峰且曲線光滑，則說明產(chǎn)物特異且單一，未出現(xiàn)非特異性擴增。若出現(xiàn)多個溶解峰或主峰異常增寬，則提示實驗可能存在引物二聚體，或存在非特異性擴增等其它非目的性產(chǎn)物。2.3.3 CDCA2 基因 mRNA 表達水平的定量分析方法本研究選擇 β-actin 作為內(nèi)參基因，通過記錄實驗組樣本和對照組樣本的內(nèi)參及目的基因 Ct 值，根據(jù)內(nèi)參的 Ct 值對目的基因進行差值校正，最

2 mRNA 在鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中的qRT-PCR方法檢測 16 例鼻咽癌組織和 16 例鼻咽部粘A2 mRNA 的相對表達量。用試驗方法部分 2.3.3 所CDCA2 mRNA的相對表達量，結(jié)果顯示：CDCA2 m鼻咽部粘膜慢性炎組織中的相對表達量分別為 559。鼻咽癌組織中 CDCA2 mRNA 的相對表達量明顯組織，P值小于 0.001，差別具有統(tǒng)計學意義（表 3 3-1. CDCA2 mRNA 在鼻咽部粘膜慢性炎組織和鼻咽癌組織中的相對表組別 例數(shù)(n) 2-ΔΔCt( ±s) P粘膜慢性炎組織(N) 16 1.148±0.759<0組織(NPC) 16 5.319±3.198

碩士研究生學位論文 CDCA2 在鼻咽癌中的表達及其對鼻咽癌細胞生物學功能的影響1.2 CDCA2 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中的表達為了比較和研究 CDCA2 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織之間的表達情況，本研究采用免疫組織化學方法對 86 例鼻咽癌患者及 51例鼻咽部粘膜慢性炎患者的組織蠟塊切片進行染色。免疫組織化學染色顯示，鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中 CDCA2 蛋白呈淡黃色或棕黃色，主要分布于細胞核上（圖 1-3）。CDCA2 蛋白在鼻咽癌組織中表達的陽性率為60.47%(52/86)，明顯高于其在鼻咽部粘膜慢性炎組織中表達的陽性率 11.76% (6/51)，且 P值小于 0.001，差別具有統(tǒng)計學意義（表 3-2）。
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本文編號：2846512