發(fā)布時(shí)間：2020-10-18 16:00

　　 目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽部粘膜的惡性腫瘤。其起病隱蔽、惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅患者的身心健康。大量研究發(fā)現(xiàn)癌基因的過度表達(dá)是鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的重要生物因素。近年來,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白2(Cell Devision Cycle Associated 2,CDCA2)在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),且其表達(dá)上調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān),但在鼻咽癌中尚未見有報(bào)道。本研究主要探討CDCA2在鼻咽癌中的表達(dá)情況及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法:1.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)技術(shù)檢測(cè)鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中CDCA2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,分析CDCA2表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系。2.應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株HK1、HONE1、5-8F、CNE1、CNE2和CNE2Z細(xì)胞中CDCA2蛋白的表達(dá),確定用于后續(xù)研究的細(xì)胞株。3.利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),敲低HK1、HONE1和5-8F細(xì)胞株中的CDCA2表達(dá)。將載有CDCA2沉默片段的慢病毒分別轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株HK1,HONE1和5-8F,建立實(shí)驗(yàn)組(HK1-shCDCA2,HONE1-shCDCA2,5-8F-shCDCA2)。轉(zhuǎn)染載有空載片段的慢病毒的細(xì)胞作為陰性空載組(HK1-shCtrl,HONE1-shCtrl,5-8F-shCtrl),未作處理的細(xì)胞為空白對(duì)照組(HK1,HONE1,5-8F)。用熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率,用qRT-PCR和WB法分別檢測(cè)各組細(xì)胞CDCA2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況,以確定沉默效果。4.采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)沉默CDCA2對(duì)HK1、HONE1和5-8F細(xì)胞增殖能力的影響。5.應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)CDCA2表達(dá)抑制對(duì)HK1、HONE1和5-8F細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。6.用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況。7.用WB檢測(cè)CDCA2是否影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.16例鼻咽癌組織和16例鼻咽部粘膜慢性炎組織中CDCA2mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為5.319±3.198,1.148±0.759。相對(duì)于鼻咽部粘膜慢性炎組織,鼻咽癌組織中CDCA2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯增高,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。CDCA2蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)的陽性率為60.47%(52/86),明顯高于其在鼻咽部粘膜慢性炎組織中表達(dá)的陽性率11.76%(6/51),且其表達(dá)與腫瘤局部浸潤(P=0.033)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.034)有關(guān)。2.與CNE1、CNE2和CNE2Z相比,HK1、HONE1及5-8F中CDCA2的基礎(chǔ)表達(dá)相對(duì)較高,因此本研究選擇此3株細(xì)胞用于后續(xù)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。3.實(shí)驗(yàn)組和陰性空載組的慢病毒轉(zhuǎn)染效率均大于90%;與陰性空載組和空白對(duì)照組相比,CDCA2 mRNA和蛋白在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)均明顯降低(P0.001),說明成功構(gòu)建了CDCA2沉默鼻咽癌細(xì)胞穩(wěn)定株。4.CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,敲低CDCA2表達(dá)后,HK1、HONE1以及5-8F細(xì)胞48h后的增殖能力顯著降低(P0.05)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的克隆形成率分別為(63.733±3.859)%、(63.467±4.601)%和(41.133±2.344)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的克隆形成率分別為(44.200±3.143)%、(45.667±2.516)%和(35.200±2.553)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的克隆形成率分別為(64.667±3.113)%、(65.667±2.516)%和(53.267±2.610)%。據(jù)此,CDCA2沉默表達(dá)后,鼻咽癌細(xì)胞克隆形成能力顯著降低(P0.05)。5.沉默CDCA2表達(dá)后,未發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞株HK1、HONE1及5-8F細(xì)胞的遷移侵襲能力發(fā)生顯著變化(P0.05)。6.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的G0+G1期細(xì)胞比例分別為(62.380±2.868)%、(62.723±1.806)%和(69.507±2.607)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的G0+G1期細(xì)胞比例分別為(33.697±1.825)%、(32.603±2.365)%和(45.320±1.360)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的G0+G1期細(xì)胞比例分別為(62.050±3.080)%、(62.810±2.440)%和(68.373±2.437)%。實(shí)驗(yàn)組較陰性空載組和空白對(duì)照組G0+G1期的細(xì)胞數(shù)明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而3株細(xì)胞在G2+M期以及S期的變化表現(xiàn)不一。用Annexin V-APC/7-AAD雙染料法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低CDCA2后,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的總凋亡率分別為(7.303±0.702)%、(7.170±0.310)%和(8.967±0.656)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的總凋亡率分別為(7.040±0.616)%、(6.907±0.708)%和(16.397±1.903)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的總凋亡率分別為(18.570±1.415)%、(17.883±1.734)%和(23.343±2.270)%。鼻咽癌細(xì)胞總凋亡率升高,差別有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。7.WB顯示,CDCA2沉默后,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)的表達(dá)顯著降低,而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21蛋白表達(dá)顯著增高;細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表達(dá)無明顯變化。結(jié)論:1.較鼻咽部粘膜慢性炎組織,CDCA2 mRNA和蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)上調(diào),且其表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤局部浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。2.CDCA2可能通過影響鼻咽癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白CDK4、CDK6和p21的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞周期,促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖,同時(shí)可能影響細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

圖 1-1. Real-Time PCR 反應(yīng)條件Figure 1-1. Real-Time PCR protpcol2.3.2 Real-time PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的判斷對(duì) Real-time PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線進(jìn)行分析，確定 β-actin 引物和CDCA2 引物是否具有特異性以及 PCR 產(chǎn)物是否單一。若熔解曲線呈特異性單一溶解峰且曲線光滑，則說明產(chǎn)物特異且單一，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。若出現(xiàn)多個(gè)溶解峰或主峰異常增寬，則提示實(shí)驗(yàn)可能存在引物二聚體，或存在非特異性擴(kuò)增等其它非目的性產(chǎn)物。2.3.3 CDCA2 基因 mRNA 表達(dá)水平的定量分析方法本研究選擇 β-actin 作為內(nèi)參基因，通過記錄實(shí)驗(yàn)組樣本和對(duì)照組樣本的內(nèi)參及目的基因 Ct 值，根據(jù)內(nèi)參的 Ct 值對(duì)目的基因進(jìn)行差值校正，最

2 mRNA 在鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中的qRT-PCR方法檢測(cè) 16 例鼻咽癌組織和 16 例鼻咽部粘A2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。用試驗(yàn)方法部分 2.3.3 所CDCA2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：CDCA2 m鼻咽部粘膜慢性炎組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為 559。鼻咽癌組織中 CDCA2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量明顯組織，P值小于 0.001，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 3 3-1. CDCA2 mRNA 在鼻咽部粘膜慢性炎組織和鼻咽癌組織中的相對(duì)表組別 例數(shù)(n) 2-ΔΔCt( ±s) P粘膜慢性炎組織(N) 16 1.148±0.759<0組織(NPC) 16 5.319±3.198

碩士研究生學(xué)位論文 CDCA2 在鼻咽癌中的表達(dá)及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響1.2 CDCA2 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中的表達(dá)為了比較和研究 CDCA2 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織之間的表達(dá)情況，本研究采用免疫組織化學(xué)方法對(duì) 86 例鼻咽癌患者及 51例鼻咽部粘膜慢性炎患者的組織蠟塊切片進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)染色顯示，鼻咽癌組織和鼻咽部粘膜慢性炎組織中 CDCA2 蛋白呈淡黃色或棕黃色，主要分布于細(xì)胞核上（圖 1-3）。CDCA2 蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)的陽性率為60.47%(52/86)，明顯高于其在鼻咽部粘膜慢性炎組織中表達(dá)的陽性率 11.76% (6/51)，且 P值小于 0.001，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 3-2）。
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