鼻咽癌是我國南方及東南亞地區(qū)常見惡性腫瘤之一,有“廣東瘤”之稱。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為鼻咽癌治療失敗的主要原因。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。端粒酶在包括鼻咽癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)。PinX1為主要的端粒酶抑制劑。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)為腫瘤轉(zhuǎn)移常見的生物學(xué)過程。目前對于鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞、端粒酶與EMT的作用關(guān)系尚不清楚。因而采用端粒酶抑制劑靶向調(diào)控端粒酶活性以抑制腫瘤干細(xì)胞及EMT的表達(dá)具有重要意義。一、CD133+鼻咽癌干細(xì)胞的分選及生物學(xué)特性目的:探究以CD133作為干細(xì)胞標(biāo)志物,分選CD133+細(xì)胞并探究其生物學(xué)特性方法:磁珠分選將鼻咽癌CNE2細(xì)胞分選為CD133+和CD133-細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)及熒光免疫對分選的效率進(jìn)行驗(yàn)證,體外成球、CCK-8以及Transwell法檢測細(xì)胞的體外成球、細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力。結(jié)果:1.以未加標(biāo)志物的CNE2細(xì)胞為對照,對磁珠分選后的細(xì)胞進(jìn)行流式及熒光免疫檢測,結(jié)果顯示CD133+細(xì)胞分選成功。2.將分選的細(xì)胞體外誘導(dǎo)成球培養(yǎng),10天后CD133+細(xì)胞形成的腫瘤細(xì)胞球半徑明顯大于CD133-細(xì)胞,且成球個(gè)數(shù)更多。3.CD133+細(xì)胞的增殖速度、遷移、侵襲能力明顯高于CD133-細(xì)胞。結(jié)論:鼻咽癌CNE2細(xì)胞磁珠分選成功分獲得CD133+鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞,CD133+鼻咽癌干細(xì)胞的體外成球、增殖、遷移、侵襲能力等腫瘤干細(xì)胞特征明顯強(qiáng)于CD133-鼻咽癌細(xì)胞。二、PinX1基因靶向端粒酶抑制鼻咽癌干細(xì)胞EMT的研究目的:探討PinX1靶向端粒酶對鼻咽癌干細(xì)胞生物學(xué)特性及其EMT的影響方法:通過QPCR及Western blot方法檢測在CD133+/-細(xì)胞中EMT的表達(dá);并在CD133+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒及空載質(zhì)粒后端粒酶的活性,并將轉(zhuǎn)染獲得的細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞誘導(dǎo)成球,CCK-8法觀察細(xì)胞增殖情況,Transwell檢測細(xì)胞的侵襲、遷移情況,QPCR及Western blot法檢測鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的EMT標(biāo)志物、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)。結(jié)果:1.對鼻咽癌EMT標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行檢測,CD133+鼻咽癌干細(xì)胞上皮化標(biāo)志物E-cadherin明顯低于CD133-細(xì)胞,間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin明顯高于CD133-細(xì)胞。2.CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒后,端粒酶活性明顯被抑制,在干細(xì)胞生物學(xué)特性方面,細(xì)胞的成球能力明顯減弱,干細(xì)胞球半徑和成球個(gè)數(shù)明顯減少;細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力明顯低于空載質(zhì)粒組。3.CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒后,E-cadherin表達(dá)明顯高于空載質(zhì)粒組,Vimentin表達(dá)明顯低于空載質(zhì)粒組;EMT轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Snai1、Twist和Zeb1的表達(dá)明顯低于空載質(zhì)粒組。結(jié)論:1、CD133+鼻咽癌干細(xì)胞較CD133-鼻咽癌細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的EMT潛能;2、PinX1基因能夠抑制CD133+鼻咽癌干細(xì)胞的端粒酶活性,從而抑制鼻咽癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性并對其表現(xiàn)出的EMT潛力產(chǎn)生抑制作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

９４］，ＰｉｎＸｌ－Ｋ２９２，ＰｉｎＸｌ－Ｋ２９４，ＰｉｎＸｌ－Ｋ２９５邋和邋ＰｉｎＸｌ－Ｒ２９７邋對親水相互作用逡逑至關(guān)重要［９３］（圖１，下排）。ＰｉｎＸｌ可能與細(xì)胞核和核質(zhì)中的ＴＲＦ丨相互作用，逡逑迫使內(nèi)源性ＴＲＦ１在核仁中積累，增加ＴＲＦ１的端粒結(jié)合，并通過抑制其降解和逡逑泛素化來增強(qiáng)ＴＲＦ１的穩(wěn)定性［８６］。ＴＲＦｌ－ＰｉｎＸｌ相互作用不僅需要將ＰｉｎＸｌ靶向逡逑端粒，還需要針對ＰｉｎＸｌ以防止細(xì)胞中的端粒延伸。此外，ＰｉｎＸｌ可通過與組裝逡逑的ＴＥＲＴ－ＴＲ復(fù)合物結(jié)合來抑制端粒酶活性。逡逑另一方面，調(diào)節(jié)染色體穩(wěn)定性是ＰｉｎＸｌ的另一個(gè)重要功能。通過基因敲除逡逑減少ＰｉｎＸｌ不僅會增加端粒酶活性和端粒長度，還會導(dǎo)致細(xì)胞模型中的染色體逡逑８逡逑

邐ｑ邐ＣＤ１３３邋Ａ逡逑圖１－１邋ＣＮＥ２細(xì)胞在分選后，流式分選鑒定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＮＥ２邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｓｏｒｔｉｎｇ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｏｒｔｉｎｇ逡逑３．２免疫熒光檢測ＣＤ１３３＋鼻咽癌細(xì)胞逡逑在無血清中培養(yǎng)３天后對分選后ＣＮＥ２細(xì)胞免疫熒光檢測：ＦＩＴＣ標(biāo)記ＣＤ１３３逡逑抗體呈綠色熒光如圖１－２－Ａ，ＤＡＰＩ核染呈藍(lán)色熒光如圖１－２－Ｂ，通過融合處理Ａ逡逑和Ｂ后，表達(dá)ＣＤ１３３占存活細(xì)胞中較大比例見圖１－２－Ｃ，說明在接下來的培養(yǎng)中，逡逑我們的細(xì)胞依舊保持著較高的ＣＤ１３３表達(dá)率。逡逑＾＾１邋ｍｉ逡逑Ａ邋ＣＤ１３３＋邐Ｂ邋ＤＡＰＩ邐Ｃ邋Ｍｅｒｇｅ逡逑圖１－２邋ＣＮＥ２細(xì)胞的免疫熒光檢測逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＮＥ２邋ｃｅｌｌｓ逡逑３．３邋ＣＤ１３３＋與ＣＤ１３３－細(xì)胞成球能力逡逑干細(xì)胞在含有生長因子的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，腫瘤千細(xì)胞的重要特點(diǎn)逡逑是可以形成千細(xì)胞球。為了檢測分選出的ＣＤ１３３＋細(xì)胞是否具有成球能力，將新逡逑２２逡逑

３．２免疫熒光檢測ＣＤ１３３＋鼻咽癌細(xì)胞逡逑在無血清中培養(yǎng)３天后對分選后ＣＮＥ２細(xì)胞免疫熒光檢測：ＦＩＴＣ標(biāo)記ＣＤ１３３逡逑抗體呈綠色熒光如圖１－２－Ａ，ＤＡＰＩ核染呈藍(lán)色熒光如圖１－２－Ｂ，通過融合處理Ａ逡逑和Ｂ后，表達(dá)ＣＤ１３３占存活細(xì)胞中較大比例見圖１－２－Ｃ，說明在接下來的培養(yǎng)中，逡逑我們的細(xì)胞依舊保持著較高的ＣＤ１３３表達(dá)率。逡逑＾＾１邋ｍｉ逡逑Ａ邋ＣＤ１３３＋邐Ｂ邋ＤＡＰＩ邐Ｃ邋Ｍｅｒｇｅ逡逑圖１－２邋ＣＮＥ２細(xì)胞的免疫熒光檢測逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＮＥ２邋ｃｅｌｌｓ逡逑３．３邋ＣＤ１３３＋與ＣＤ１３３－細(xì)胞成球能力逡逑干細(xì)胞在含有生長因子的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，腫瘤千細(xì)胞的重要特點(diǎn)逡逑是可以形成千細(xì)胞球。為了檢測分選出的ＣＤ１３３＋細(xì)胞是否具有成球能力，將新逡逑２２逡逑

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本文編號：2834580