研究目的和意義本研究擬通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、膠原沉積、炎癥因子表達(dá)等生物學(xué)行為和過程的影響,初步查明ERS與白內(nèi)障的關(guān)系以及ERS參與白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展調(diào)控的機(jī)制。單核甘酸多態(tài)性是基因組最常見的遺傳多態(tài)性形式,對(duì)金屬基質(zhì)蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP-2)基因 rs243865 位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)和分析,為白內(nèi)障遺傳易感性與基因多態(tài)性的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),也可能為白內(nèi)障的臨床治療提供新的手段。本研究豐富了白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究,為尋找白內(nèi)障潛在的生物學(xué)治療靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)支持。對(duì)候選基因的多態(tài)性分析,也可能為研發(fā)治療藥物和治療手段提供新的思路,具有十分重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。方法1.將20只8日齡無特殊病原體(Specific pathogen free,SPF)級(jí)大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組,模型組大鼠按20 μ mol/kg一次性經(jīng)腹腔注射亞硒酸鈉溶液,隔日注射一次,連續(xù)5次,誘導(dǎo)建立硒性白內(nèi)障大鼠模型,通過裂隙燈觀察和病理檢查驗(yàn)證造模成功。對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水,其余操作同模型組。2.體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞,隨機(jī)分為ERS激活劑組、ERS抑制劑組和對(duì)照組,分別給予細(xì)胞相應(yīng)的處理措施。Western Blot檢測(cè)各組晶狀體上皮中ERS標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78/免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Glucose regulation protein-78/Binding Protein 1,GRP78/Bip)、激酶 R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子(Activating transcription factor 4,ATF4)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)的表達(dá)水平,以及與晶狀體上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、鈣粘附蛋白E(E-cadherin)、MMP-2表達(dá)水平;MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;免疫組化檢測(cè)晶狀體上皮中ⅣV膠原沉積情況;ELISA檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)。3.利用TaqMan-MGB探針對(duì)晶狀體上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的MMP-2基因rs243865位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)和分析,初步探索MMP-2基因多態(tài)性與白內(nèi)障易感性的關(guān)系。結(jié)果1.用20 μ mol/kg亞硒酸鈉溶液經(jīng)腹腔隔日注射5次,10天即成功在模型組大鼠中誘導(dǎo)出硒性白內(nèi)障,建模成功率100%;其中晶狀體Ⅱ級(jí)渾濁2例(20%),Ⅲ級(jí)渾濁3例(30%),Ⅳ級(jí)渾濁3例(30%),Ⅴ級(jí)渾濁1例(10%),Ⅵ級(jí)渾濁1例(10%)。2.HE染色后可見模型組大鼠晶狀體正常上皮和異常上皮相間分布,異常上皮可見水腫、形態(tài)和大小不一,胞質(zhì)淡然疏松,有大量空泡,核多形性,細(xì)胞間隙增大;纖維粗細(xì)不均一、排列無規(guī)律,纖維之間有囊泡和水裂,可見扭曲、斷裂。3.白內(nèi)障大鼠晶狀體組織中GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的(3.89±0.22)倍(p0.01)、(2.97±0.09)倍(p0.01)、(2.15±0.17)倍(p0.01)和(3.11±0.19)倍(p0.01)。4.ERS激活劑組SRA01/04細(xì)胞GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組細(xì)胞的(1.76±0.11)倍(p0.01)、(3.62±0.17)倍(p0.01)、(3.35 ± 0.13)倍(p0.01)和(4.39±0.20)倍(p0.01);ERS 抑制劑組細(xì)胞GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組細(xì)胞的(0.43 ±0.05)倍(p0.01)、(0.52±0.08)倍(p0.01)、(0.32±0.06)倍(p0.01)和(0.29 ± 0.04)倍(p0.01)。5.ERS 激活劑組SRA01/04 細(xì)胞第 Ohr、12 hr、24 hr、48 hr、72 hr 和 96 hr存活率分別為(102±5)%,(108±9)%,(119±6)%,(134±5)%,(152±8)%,(168±8)%;ERS 抑制劑組 SRA01/04 細(xì)胞第 Ohr、12 hr、24 hr、48 hr、72 hr 和 96 hr 存活率分別為(102±4)%,(117 ± 7)%,(130±6)%,(162±7)%,(186±8)%,(209±8)%。ERS 激活劑處理的晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線整體在對(duì)照組下方,其中第48 hr、72 hr和96 hr的存活率與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);ERS抑制劑處理的晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線整體在對(duì)照組上方,其中第48 hr和72 hr的存活率與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。6.ERS激活劑組SRA01/04細(xì)胞凋亡率為(15.83±1.07)%,較對(duì)照組細(xì)胞的(7.94±0.56)%顯著升高(p0.01);ERS抑制劑處理的SRA01/04細(xì)胞凋亡率為(5.05±0.71)%,較對(duì)照組細(xì)胞降低(p0.05)。7.ERS激活劑組SRA01/04細(xì)胞α-SMA、E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的(2.78±0.13)倍、(0.29±0.09)倍和(1.70±0.08)倍(p均0.01);ERS 抑制劑組 SRA01/04 細(xì)胞α-SMA、E-cadherin 和 MMP-2 表達(dá)水平分別是對(duì)照組的(0.17±0.06)倍、(2.89±0.12)倍和(0.20±0.07)倍(p 均0.01)。8.ERS激活劑組SRA01/04細(xì)胞中ⅣV膠原大量沉積,平均光密度為(0.65 ±0.08),明顯高于對(duì)照組的(0.23±0.03)(p0.01);ERS抑制劑處理組細(xì)胞中ⅣV膠原平均光密度為(0.11 ± 0.06),低于對(duì)照組(p0.05)。9.ERS激活劑組SRA01/04細(xì)胞IL-1 β、IL-6、CRP和TNF-lα表達(dá)水平分別為(42.53±4.14)ng/ml、(6.17±2.51)ng/ml、(9.27±0.80)mg/L 和(25.22±3.28)ng/ml;ERS 抑制劑組晶狀體上皮 IL-1 β、IL-6、CRP 和 TNF-1α表達(dá)水平分別為(28.52 ± 5.00)ng/ml、(3.23±2.01)ng/ml、(2.01 ±0.35)mg/L 和(11.17±2.01)ng/ml;對(duì)照組晶狀體上皮 IL-1 β、IL-6、CRP和 TNF-1α表達(dá)水平分別為(30.47 ± 4.83)ng/ml、(4.41±1.74)ng/ml、(2.23±0.29)mg/L 和(15.57±3.08)ng/ml。ERS 激活劑組晶狀體上皮IL-1 β、IL-6、CRP和TNF-1α水平高于對(duì)照組(p0.05),ERS抑制劑組IL-6和TNF-1α水平低于對(duì)照組(p0.05)。10.白內(nèi)障組CC、CT和TT 3種基因型的檢測(cè)頻率和期望頻率分別為62%和57.01%,30%和 39.90%,12%和 7.01%;對(duì)照組 CC、CT 和 TT 3 種基因型的檢測(cè)頻率和期望頻率分別為72%和70.04%,25%和26.20%,3%和2.40%。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗(yàn),兩組MMP-2基因的rs243865基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(p0.05),具有可比性。11.白內(nèi)障組患者M(jìn)MP-2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs243865的GG、GA、AA三種基因型分布人數(shù)分別是62例、30例和12例,分別占57.01%、28.85%和11.54%;對(duì)照組MMP-2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs243865的GG、GA、AA三種基因型分布人數(shù)分別是72例、25例和3例,分別占72%、25%和3%。三種基因型在兩組分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。12.白內(nèi)障組患者C和T等位基因分布頻率分別為74.04%和25.96%,對(duì)照組C和T等位基因分布頻率分別為84.50%和15.50%,C/T等位基因在兩組的分布頻率有差異(p0.05)。13.對(duì)MMP-2基因rs243865的遺傳模型分析,白內(nèi)障組和對(duì)照組在加性模型下存在差異(p0.05),但隱性模型和顯性模型均無顯著差異(p0.05)。結(jié)論1.白內(nèi)障大鼠晶狀體組織中存在過度激活的ERS反應(yīng),ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平較正常大鼠明顯升高;2.過度激活的ERS能抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、膠原沉積和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)行為和過程,對(duì)白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用。3.MMP-2基因的rs243865位點(diǎn)多態(tài)性與人類白內(nèi)障易感性相關(guān)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R776.1
【部分圖文】：

Ａ邐Ｂ逡逑圖１亞砸酸鈉誘導(dǎo)大鼠形成白內(nèi)障逡逑Ａ．對(duì)照組，Ｂ．模型組逡逑狀體ＨＥ染色檢g義咸逕掀ぞ齲湃舊蟀史酆焐順首俠渡�。模型讬沃查V帕�，但局舱n陜遙嗷ブ浣縵薏磺宄Ｉ掀ず鴕斐Ｉ掀ば翁還嬖潁笮〔灰恢?jǐn)n赴杉�、胞謱�(shí)嘈渦韻赴�，细胞间蠈�(duì)齟螅幌宋宀閂帕形陜遙撕退�；纤维臭溨不同程独@蘋擔(dān)硐治窒覆瘓�、排可见扭曲、丢M�，丢M衙嫜刈葜嶙呦潁湮炎�，聝鳊}�，；纤维钡a嬙黃鵪蘋擔(dān)杉言殘巍奧硎閑√濉背磷嘔蚩

本文編號(hào)：2834516