【目的】腺樣囊性癌是淚腺區(qū)最常見的惡性腫瘤,在臨床診療中我們發(fā)現(xiàn)該腫瘤具有易復發(fā)蔓延生長及遠處轉(zhuǎn)移的特性,影響治療效果和預(yù)后,為了解決這個問題進行了很多研究,近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNA參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,其可以通過調(diào)控靶基因影響信號通路,對腫瘤細胞功能起抑制或促進作用。本研究的目的是通過miR-222-3p對腺樣囊性癌細胞增殖、遷移、侵襲功能的影響,預(yù)測和確定miR-222-3p直接作用的靶基因,進而闡明miR-222-3p與淚腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的分子機制�！痉椒ā坷脤崟r定量PCR方法檢測miR-222-3p在腺樣囊性癌細胞ACC-2和ACC-M中的表達差異。用MTT試驗、集落形成試驗檢測miR-222-3p對腺樣囊性癌細胞系A(chǔ)CC-2和ACC-M活性和增殖能力的影響,用transwell遷移和侵襲實驗檢測miR-222-3p對ACC-2和ACC-M遷移和侵襲能力的影響,并用western blot檢測了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin、ICAM-1的表達差異。生物信息學方法預(yù)測并篩選出miR-222-3p的候選靶基因ARNT,并用EGFP熒光報告載體實驗驗證miR-222-3p對ARNT的直接靶定作用,在mRNA和蛋白水平檢測腺樣囊性癌細胞系A(chǔ)CC-2和ACC-M中miR-222-3p對ARNT的影響。在腺樣囊性癌細胞系中過表達或封閉靶基因ARNT后,用上述細胞表型試驗檢測了ARNT對細胞功能的影響,并用挽救實驗驗證ARNT對miR-222-3p功能上的挽救作用,EMT相關(guān)標志物檢測初步探討ARNT影響遷移和侵襲的機制�！窘Y(jié)果】通過實時定量PCR檢測,在ACC-M中miR-222-3p較ACC-2明顯升高。在腺樣囊性癌細胞中過表達miR-222-3p后,細胞的增殖、遷移和侵襲力增強,從而促進了腫瘤細胞的EMT過程,E-cadherin蛋白表達減少、Vimentin、ICAM-1蛋白表達增加。熒光報告載體實驗結(jié)果顯示miR-222-3p能夠直接作用于ARNT的3'UTR區(qū),并對其表達進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。ARNT作為miR-222-3p的靶基因,實時定量PCR和western blot實驗結(jié)果顯示在腺樣囊性癌細胞中過表達或封閉miR-222-3p后,ARNT的mRNA表達水平和蛋白表達水平隨之降低或升高。腺樣囊性癌細胞轉(zhuǎn)染過表達ARNT后,細胞增殖能力降低、細胞的遷移能力降低,侵襲能力降低,抑制細胞EMT過程。挽救實驗驗證外源性ARNT能夠部分抵消miR-222-3p對腺樣囊性癌細胞功能的影響�！窘Y(jié)論】miR-222-3p通過靶定ARNT促進腺樣囊性癌細胞增殖、遷移和侵襲、促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,起到了類似促癌基因的作用,在淚腺腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展中,參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程,為研究和治療淚腺腺樣囊性癌開拓了新的領(lǐng)域和思路。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.7
【部分圖文】：

圖 1.1 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳 1.2 qRT-PCR 檢測 ACC-2 和 ACC-M 細胞作為內(nèi)參，將 ACC-2 中 miR-222-3p 的值 值進行比對，*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0

18圖 1.2 qRT-PCR 檢測 ACC-2 和 ACC-M 細胞中 miR-222-3p 表達 U6 作為內(nèi)參，將 ACC-2 中 miR-222-3p 的值標化為 1，ACC-22-3p 值進行比對，*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。轉(zhuǎn)染效率用脂質(zhì)體將綠色熒光質(zhì)粒 pcDNA3/EGFP 轉(zhuǎn)染 ACC-2 和 ACC-M養(yǎng) 24-36h 后，將細胞置于熒光顯微鏡明暗場觀察轉(zhuǎn)染效率。實驗 EGFP 的 ACC-2 細胞在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，明場為普通胞，兩者相比 ACC-2 細胞的轉(zhuǎn)染效率為 50%左右；轉(zhuǎn)染 EGFP 的

圖 1.3 熒光顯微鏡檢測兩種腺樣囊性癌細胞的轉(zhuǎn)染效率1.2.3 在腺樣囊性癌細胞中轉(zhuǎn)染過表達和封閉質(zhì)粒有效性的驗證為 了 研 究 miR-222-3p 的 功 能 ， 構(gòu) 建 了 pcDNA3/pri-mpSilencer/antigomer-miR-222-3p質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序確定了質(zhì)然后對腺樣囊性癌細胞 ACC-M 和 ACC-2 瞬時轉(zhuǎn)染，提取細miR-222-3p 的表達水平。在兩種不同的腺樣囊性癌細胞中，轉(zhuǎn)染 p組的細胞的 miR-222-3p 表達水平均比對照組有明顯提高，ACC-M28.6 倍，ACC-2 細胞系提高 14.5 倍（圖 1.4）。轉(zhuǎn)染封閉質(zhì)粒 antigom后，miR-222-3p 表達量顯著下降。ACC-M 細胞的表達為對照組的細 胞 的 表 達 為 對 照 組 的 39% 。 說 明 構(gòu) 建 的 pcDNA3/pri-mpSilencer/antigomer-miR-222-3p 質(zhì)粒是有效的。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2833226