研究目的:時空特異性基因敲除是研究小鼠內(nèi)耳基因功能的重要手段,它可以避免傳統(tǒng)基因敲除導(dǎo)致的嚴(yán)重發(fā)育畸形和出生后死亡。但現(xiàn)有的內(nèi)耳毛細(xì)胞基因敲除工具多為不可誘導(dǎo)的Cre重組酶,無法對成年小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞基因進(jìn)行高效的時間特異性敲除。為了更好地實現(xiàn)對成年小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞中基因功能的研究,我們設(shè)計構(gòu)建了新型內(nèi)耳毛細(xì)胞時空特異性基因敲除工具Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠,并對其GCE重組酶的功能進(jìn)行了鑒定。研究方法:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠的構(gòu)建主要采用了胚胎干細(xì)胞顯微注射的方法,將成功轉(zhuǎn)染的帶有Gfi1-P2A-GFP-CreERT2目的基因片段的胚胎干細(xì)胞顯微注射進(jìn)E3.5天的小鼠囊胚中,通過胚胎移植的方法移植到代孕母鼠子宮,最后獲得Gfi1GEC/Neo嵌合體小鼠。經(jīng)過多次交配后可得到穩(wěn)定遺傳的Gfi1GCE/+小鼠。通過長距離PCR、免疫熒光染色、耳蝸wholemount染色及聽覺腦干反應(yīng)檢測等方法,對Gfi1GCE/+小鼠進(jìn)行了鑒定。通過對Gfi1GC/+小鼠與Rosa26tdTomato reporter小鼠交配得到的Gfi1GGCE/+;Rosa26tdTmato小鼠進(jìn)行研究,鑒定了 GCE重組酶的功能并找到了實現(xiàn)Gfi1GC/+GCE重組酶最佳酶切效率的Tamoxifen誘導(dǎo)方案。研究結(jié)果:基因型鑒定LR-PCR得到的1.7kb的5'端DNA序列和1.1kb的3'端序列以及使用AcGFP引物鑒定得到的508bp的DNA序列均可證明P2A-GFP-CreERT2 DNA序列被成功插入到小鼠Gfi1第6外顯子之后,確定Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠構(gòu)建成功。Gfi1GCE/+小鼠中GFI1與GFP共表達(dá),且Gfi1基因的表達(dá)和功能不受基因重組的影響,即Gfi1GCE/GCE純合小鼠無聽力下降、平衡失調(diào)等內(nèi)耳發(fā)育缺陷。在GCE重組酶誘導(dǎo)方案方面,研究明確了對小鼠連續(xù)5天腹腔注射Tamoxifen 1mg/次,可實現(xiàn)耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞內(nèi)基因接近100%的敲除。研究結(jié)論:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠構(gòu)建成功,可以實現(xiàn)可誘導(dǎo)的內(nèi)耳毛細(xì)胞內(nèi)基因的高效、時空特異性敲除。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;R764
【部分圖文】：

４．邋２．邋２小鼠交配方法逡逑詳細(xì)小鼠交配情況見圖３。逡逑＾邋＾逡逑Ｇｆ＂ＣＣ￡／Ａｆｅ。小鼠邋Ｘ邋凡尸／ｆ小鼠逡逑Ｖ邐／邐Ｖ邐／逡逑ＦＩ邋ｉｐｐａｓｅ邋介導(dǎo)敲除Ｋｅｏ逡逑／邐Ｎ｜邐邐Ｎ逡逑Ｇｆｉｌ＾＾；邋ＦＬＰ

組成試劑邐體系（２０ｕＬ）逡逑２Ｘ邋Ｐｒｅｍｉｘ邋Ｔａｑ邐１０邋ｕ邋Ｌ逡逑１０邋ｕ邋Ｍ邋ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ邐１邋ｕ邋Ｌ逡逑１０邋ｕ邋Ｍ邋ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ邐１邋ｕ邋Ｌ逡逑ＤＮＡ模板邐ｌｕＬ逡逑ｄｄＨ２０邐７邋ｕＬ逡逑表２．邋ＰＣＲ反應(yīng)體系逡逑②反應(yīng)條件：逡逑°°°°°°

，共有６個外顯子組成（圖５－Ａ）。由于編碼Ｐ２４－的基因序列到Ｇｆｉ＿ｉ基因第６外顯子的Ｃ端之后，因此Ｐ２４－ＧＦＰ－ＣｒｅＭＴ２的表達(dá)和翻譯響載體基因ＣｆＨ的表達(dá)和翻譯。同時Ｐ２Ａ肽鏈的翻譯后自動斷裂的特性使得ＧｆＰ－ＣｒｅＭＤ表達(dá)和翻譯后的產(chǎn)生的蛋白質(zhì)——ＧＦＰ蛋白和ＣｒｅＥＲＴ２蛋白與ＧＦ白自動分離，因此不會影響ＧＦＩ１在內(nèi)耳生長發(fā)育及聽覺維持中的正常功能。便質(zhì)粒的篩選，／＾ｌ－ＧｆＦ－Ｃｒｅ￡７？７＾序列之后插入了一段兩端帶有同向ＦＲＴ序ＧＫ－Ｎｅｏ編碼序列。逡逑

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本文編號：2831783