目的:通過建立高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的動物模型,觀察β-欖香烯對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用快速有效的miRNA基因芯片技術(shù),檢測正常對照組、模型組、治療組三組小鼠視網(wǎng)膜組織的miRNA表達(dá)差異,應(yīng)用生物信息學(xué)方法及熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)初步解析β-欖香烯抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的分子機(jī)制。方法:將C57BL\6J7日齡小鼠36只隨機(jī)分為正常對照組、模型組、治療組各12只。模型組和治療組在高氧環(huán)境中建立視網(wǎng)膜新生血管動物模型,治療組在生后第12天眼內(nèi)給予玻璃體腔內(nèi)注射β-欖香烯1ul后,在生后第17天三組分別摘除眼球,進(jìn)行HE染色、ADP酶視網(wǎng)膜鋪片以及透射電鏡下觀察視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)變化,評價β-欖香烯抑制鼠視網(wǎng)膜新生血管的作用。提取三組小鼠視網(wǎng)膜組織,分別置于加有Trizol溶液的Ep管中,干冰保存送往上�？党缮镉邢薰具M(jìn)行miRNA檢測,篩選出正常組、模型組、治療組中視網(wǎng)膜組織表達(dá)顯著差異的microRNAs。根據(jù)芯片檢測結(jié)果,設(shè)計mir-23a、mir-22、mir-93、mir-106a、mir-19b、mir-190b、mir-34a的莖環(huán)引物進(jìn)行SYBR Green Real-time PCR相對定量法測定,應(yīng)用TargetScan、Miranda、RNA hybrid三種軟件對上述7種microRNAs進(jìn)行靶基因的預(yù)測。通過Real-time PCR技術(shù)檢測正常組、模型組、治療組小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF的mRNA表達(dá)量,免疫組化方法檢測三組視網(wǎng)膜組織中VEGF蛋白表達(dá)量。獲得小鼠VEGF 3’UTR片段1800bp(包含mir-23a與VEGF相結(jié)合的作用位點),插入熒光素酶表達(dá)載體中,構(gòu)建重組熒光素酶報告基因載體pMIR-REPORT-VEGF,與mir-23a mimic共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK)293細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞裂解液,測定熒光素酶活性觀察mir-23a對外源性靶基因表達(dá)的抑制作用。同時共轉(zhuǎn)染?-半乳糖苷酶(?-galactosidase)質(zhì)粒,檢測?-galactosidase活性以校正組間轉(zhuǎn)染效率的差異,同時以RNA雙鏈寡核苷酸及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為陰性對照。芯片結(jié)果采用miRCURYLNA基因芯片管理平臺GenePix Pro 6.0 software軟件建立實驗信息,采用Volacano Plot filtering對各張芯片信號值進(jìn)行頻率分布分析,Fold change1.5或0.67,認(rèn)為miRNA在組間有差異性表達(dá),數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)處理P0.05認(rèn)為miRNA在組間表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;用MEV軟件進(jìn)行聚類分析,其他數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0軟件處理和分析數(shù)據(jù),P0.05表示差異具有顯著性。結(jié)果:1、形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果(1)組織學(xué)檢查及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù):各組小鼠生后第17天視網(wǎng)膜組織切片HE染色:光鏡下觀察并計數(shù)突出內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核個數(shù),即新生血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù),正常對照組偶見突出內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核,平均每張切片突出內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)為(0.23±0.11)個;OIR模型組見大量突出內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞,平均每張切片突出內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)為(30.73±5.11)個,與正常組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.001)。治療組平均每張切片突出內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)為(12.13±0.19)個,較其對側(cè)眼明顯減少,兩組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05),與模型組比較也明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。組織切片檢查未見毒性反應(yīng)。(2)ADP酶視網(wǎng)膜鋪片:正常對照組生后第17天視網(wǎng)膜血管從視乳頭發(fā)出后,向四周呈放射狀均勻分布,直至視網(wǎng)膜周邊部;而OIR模型組生后第17天視網(wǎng)膜中周部見新生血管形成,后極部可見大片無灌注區(qū),血管走形迂曲;治療組生后第17天視網(wǎng)膜新生血管較OIR模型組明顯減少,血管擴(kuò)張迂曲好轉(zhuǎn)。(3)透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)變化:正常對照組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)未見異常改變;OIR模型組雙極細(xì)胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變,感光細(xì)胞膜盤間隙增寬、數(shù)量減少,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變;治療組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)趨于恢復(fù)正常。2、確認(rèn)在正常對照組、模型組、治療組小鼠視網(wǎng)膜組織表達(dá)有變化的miRNA種類(1)與正常組相比,模型組中共檢測出54個差異表達(dá)的microRNAs,其中43種microRNA表達(dá)下調(diào),11種microRNA表達(dá)上調(diào),其中差異明顯(差異倍數(shù)5,P0.05)下調(diào)的miRNA有3個,包括mir-22、mir-23a、mir-190b。(2)與模型組相比,治療組中共檢測出54個差異表達(dá)的microRNAs,其中44種microRNA表達(dá)上調(diào),12種microRNA表達(dá)下降,其中差異明顯(差異倍數(shù)3,P0.05)上調(diào)的miRNA有5個,包括mir-22、mir-23a、mir-181a-1*、mir377、mir17*;下調(diào)的miRNA有3個,包括mir-872、mir-19b、mir-26b。(3)在疾病模型發(fā)生過程及治療過程中表達(dá)均發(fā)生差異的microRNAs芯片結(jié)果顯示,43種microRNAs在疾病模型組中表達(dá)下降,其中23種microRNAs經(jīng)治療后表達(dá)有所增加,在模型組中表達(dá)上調(diào)的11種microRNAs中,miR-19b在治療組中表達(dá)下降。(4)Real-time PCR驗證部分差異表達(dá)的microRNAs,分別為miR-190b、miR-93、miR-106a、miR-22、miR-19b、miR-23a、miR-34a,與芯片篩選結(jié)果一致。3、miRNA的靶基因預(yù)測及確認(rèn)(1)靶基因預(yù)測結(jié)果:miR-23a與VEGF3’端UTR區(qū)存在結(jié)合位點,預(yù)測VEGF是miR-23a的靶基因之一。(2)免疫組化染色檢測VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果:采用光密度值表示,正常組32.17±20.98,模型組144.04±65.72,治療組55.56±36.69,與正常組比較模型組VEGF表達(dá)上調(diào)(p0.01),與模型組比較治療組中VEGF表達(dá)下降(p0.01)。(3)SYBR Green法實時定量PCR檢測VEGF的mRNA水平結(jié)果顯示:與正常對照組相比,模型組視網(wǎng)膜組織中VEGF表達(dá)量升高約5.31倍(P0.05),與模型組相比,治療組中VEGF mRNA水平無明顯變化(P0.05)。(4)實驗組(PMIR-VEGF3’UTR質(zhì)粒與miR-23a mimic共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞)的相對熒光素酶活性較對照組(PMIR-VEGF3’UTR質(zhì)粒與陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞)降低約6倍(p0.0001),對于PMIR空質(zhì)粒,實驗組(PMIR-空質(zhì)粒與miR-23a mimic共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞)的相對熒光素酶活性較對照組(PMIR-空質(zhì)粒與陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞)無明顯變化p0.05。結(jié)論:1、高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型成模率達(dá)100%,β-欖香烯對小鼠視網(wǎng)膜新生血管有明顯抑制作用。2、利用miRCURYLNA芯片技術(shù)對C57BL\6J7日齡小鼠正常對照組、視網(wǎng)膜新生血管模型組、β-欖香烯治療組三組視網(wǎng)膜組織進(jìn)行miRNA表達(dá)差異的檢測:與正常組相比,模型組表達(dá)明顯(差異倍數(shù)5,P0.05)下調(diào)的miRNA有3個,包括mir-22、mir-23a、mir-190b;與模型組相比,治療組表達(dá)明顯(差異倍數(shù)3,P0.05)上調(diào)的miRNA有5個,包括mir-22、mir-23a、mir-181a-1*、mir377、mir17*,下調(diào)的miRNA有3個,mir-872、mir-19b、mir-26 b;我們發(fā)現(xiàn)在模型組中表達(dá)下調(diào),治療組表達(dá)上調(diào)的miRNA是mir-22、mir-23a、mir-34a、mir-19b、mir-181a-1*、mir-335-5 p、mir-433、mir-669n、mir-190、mir-93、mir-99b、mir-130b、mir-1274a、mir-135b、mir-151-5p、mir-153、mir-218、mir-361、mir-423-5p、mir-467g、mir-298、mir-767、mir-674等23種。這些microRNAs可能是β-欖香烯治療視網(wǎng)膜新生血管的潛在機(jī)制之一,對視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生發(fā)展起著精細(xì)的調(diào)控作用。3、與模型組相比,治療組中VEGF的mRNA表達(dá)水平無明顯變化(P0.05),但是蛋白表達(dá)水平下降,說明VEGF受到了翻譯及其以后水平的調(diào)控。4、體外實驗表明:mir-23a可以抑制HEK293外源性VEGF的表達(dá)水平。提示mir-23a介導(dǎo)的VEGF水平下降參與了β-欖香烯對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用,初步闡明β-欖香烯可通過mir-23a調(diào)控的VEGF信號傳導(dǎo)途徑抑制視網(wǎng)膜新生血管的生成。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R774.1
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果.1 組織學(xué)檢查及視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核計數(shù)各組小鼠生后第 17 天視網(wǎng)膜組織切片 HE 染色，光鏡下觀察并計數(shù)突出內(nèi)界新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核個數(shù)，正常對照組偶見突出內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核，平均每片突出內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)為（0.23±0.11）個（圖 1A）；OIR 模型組見突出內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞，平均每張切片突出內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)30.73±5.11）個（圖 1B），與正常組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.001）；治平均每張切片突出內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)為（12.13±0.19）個（圖 1C），型組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.05)。組織切片檢查未見毒性反應(yīng)。

A B C圖 2 光鏡下觀察視網(wǎng)膜鋪片 ADP 酶染色結(jié)果×200。A 為正常對照組小鼠在生后第 17 天視網(wǎng)膜血管從視乳頭發(fā)出后 ，向四周呈放射狀均直至視網(wǎng)膜周邊部；B 為 OIR 模型組視乳頭周圍及后極部可見大面積無灌注區(qū)形成；組視網(wǎng)膜新生血管較 OIR 模型組明顯減少。 電鏡觀察OIR 模型組感光細(xì)胞外節(jié)膜盤間隙增寬，排列紊亂，數(shù)量減少; 神經(jīng)節(jié)細(xì)腫脹、嵴脫落、空泡樣變(圖 4)；雙極細(xì)胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)趨于恢復(fù)正常（圖 5）；正常對照組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)未見（圖 6）。

A B C圖 2 光鏡下觀察視網(wǎng)膜鋪片 ADP 酶染色結(jié)果×200。 為正常對照組小鼠在生后第 17 天視網(wǎng)膜血管從視乳頭發(fā)出后 ，向四周呈放射狀至視網(wǎng)膜周邊部；B 為 OIR 模型組視乳頭周圍及后極部可見大面積無灌注區(qū)形成視網(wǎng)膜新生血管較 OIR 模型組明顯減少。電鏡觀察IR 模型組感光細(xì)胞外節(jié)膜盤間隙增寬，排列紊亂，數(shù)量減少; 神經(jīng)節(jié)脹、嵴脫落、空泡樣變(圖 4)；雙極細(xì)胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)趨于恢復(fù)正常（圖 5）；正常對照組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)未圖 6）。

【參考文獻(xiàn)】

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1 程鈞;萬磊;劉廷;劉偉吉;董曉光;;小鼠視網(wǎng)膜組織石蠟切片制作方法的探討[J];眼科新進(jìn)展;2009年03期

2 王偉;謝立信;董曉光;臧新杰;;內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)移抑制視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究[J];中華眼科雜志;2006年02期

3 李養(yǎng)軍,惠延年;IGF-I對視網(wǎng)膜新生血管形成的調(diào)控及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[J];國際眼科雜志;2005年05期

4 李瑩,鄒留河,盧海,潘志強(qiáng),戴洪雷,張玲,武宇影,徐亮;欖香烯抑制角膜新生血管的實驗研究[J];眼科新進(jìn)展;2004年04期

5 劉廷;董曉光;王瑤;閆妍;張靜靜;;鼠視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生過程中Twist基因的表達(dá)[J];中華眼科雜志;2008年07期

6 閔曉潔;周慶軍;劉廷;銀紅梅;董曉光;謝立信;;高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)變化[J];中華眼科雜志;2009年03期

本文編號：2831634