發(fā)布時間：2020-09-24 10:35

　　 目的:糖尿病視網膜病變是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一,并且是目前世界主要致盲眼病之一,隨著糖尿病視網膜病變進展為增殖期,伴隨著新生血管形成,牽拉因素將導致玻璃體積血和視網膜脫離,并最終造成不可逆的失明。就現在而言,增殖性糖尿病視網膜病變的最佳治療方法是手術治療,其原理為在解剖學上去除纖維血管膜帶來的的牽拉效應,從而挽救患者的視力。為了尋找早期干預糖尿病視網膜病變的新靶點,從源頭預防患者視力的大幅度下降,我們選擇目前熱門的RNA測序作為主要方法。RNA測序作為主要的轉錄組分析系統(tǒng),通過它闡明人外周血轉錄組的復雜性,對于篩選增殖性糖尿病性視網膜病變的候選基因是必不可少的。方法:我們選擇了天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院眼底病與眼外傷科的6名住院病人。根據我國糖尿病視網膜病變6級分期標準(1987),其中有3名患者被診斷為增殖期糖尿病視網膜病變(即PDR組),另外3名患者未患有糖尿病(即對照組)。對以上6名患者進行靜脈采血,血液樣本液氮凍存后送至諾和致源公司進行RNA測序。諾和致源公司經標準化流程提取外周血總RNA,經總RNA樣本檢測、文庫構建、文庫質檢和測序后,我們得到了兩組患者的原始數據。通過對原始數據的生物信息分析,我們得到了本次基因選擇性表達的最終分析結果。結果:我們得到了兩組患者的原始數據,即原始讀段,在質量控制和序列比對之后,可得到正確讀段,其數目在46111478-56703914之間,外顯子區(qū)的讀段分布率為86.7%-93.2%。進行基因表達水平分析和基因結構分析結果顯示,PDR組與對照組之間有82個差異表達基因(p0.05,錯誤發(fā)現率q0.05),其中上調基因19個,下調基因63個,同組內基因表達模式相似。基因本體論和通路分析表明,這82種選擇性表達的基因在特定的生物學過程得到富集。我們查閱文獻和相關網站尋找與增殖、遷移、分化和新生血管形成功能有關聯的基因,并結合本次RNA測序兩組間相同基因選擇性表達的結果,最終篩選出涉及不同生物學信號通路的26個候選基因�；诓煌纳镄盘柾啡缬薪z分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路等,我們在這26個候選基因中選擇了9個基因通過聚合酶鏈式反應進行進一步的驗證,驗證結果表明DUSP2和DUSP5是影響增殖性糖尿病視網膜病變形成的最有希望的候選基因。結論:本研究使用RNA測序探索了人類外周血轉錄組的復雜性,并且對測序結果進行了生物信息分析。最終,我們發(fā)現DUSP2和DUSP5可能與增殖性糖尿病視網膜病變有關,而RNA測序也可能成為探索治療疾病新靶點的常用方法。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R774.1
【部分圖文】：

入適量的 DEPC 水溶解引物干粉，將其變?yōu)?100mM 體系，再按照需求按 1:1:3的比例對應取上游引物、下游引物和 DEPC 水適量，加入 EP 管混勻待用。此時EP 管中為 20mM 的上、下游引物混合物。qRT-PCR 按標準程序進行。qPCR 的反應體系（8μL）為：每孔加入 cDNA模版 2μL，上、下游引物混合物共 2μL，Syb Green 4μL。注意加入 Syb Green 之后的步驟應避光進行。將 qPCR 用 384 孔板蓋膜后壓實，剪刀減去多余的膜以免進行反應時膜邊緣卷起。4℃ 1200r 離心 5min 后上機。反應程序：50℃ 2min；95℃ 10 min；95℃ 15s，60℃ 1min，40 個循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s 解離。2.1.5 數據處理拷貝結果后，觀察其 CT 值，采用 2 -ΔΔct 法分析數據。2.2 結果我們將兩組的 CT 值進行對照，結果展示如圖 1.

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本文編號：2825623