發(fā)布時(shí)間：2020-09-22 11:11

　　 研究目的 1.從喉鱗狀細(xì)胞癌差異性microRNA表達(dá)譜中篩選相關(guān)的miRNA進(jìn)行研究;2.利用生物信息學(xué)方法預(yù)測hsa-miR-301a-3p靶基因并對(duì)靶向調(diào)控關(guān)系加以驗(yàn)證;3.研究hsa-miR-301a-3p和靶基因Smad4在喉鱗癌/癌旁正常黏膜新鮮標(biāo)本、石蠟標(biāo)本和細(xì)胞株中的表達(dá)情況及相關(guān)性,結(jié)合臨床病理參數(shù)評(píng)價(jià)它們的臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系;4.研究hsa-miR-301a-3p和Smad4對(duì)喉鱗癌細(xì)胞增殖、克隆、遷移、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的影響,明確它們的生物學(xué)功能;5.研究hsa-miR-301a-3p和Smad4參與喉鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)機(jī)制。研究方法 1.結(jié)合文獻(xiàn)資料,從課題組已獲得的喉鱗癌差異性microRNA表達(dá)譜中獲取相關(guān)的miRNA;2.結(jié)合生物信息學(xué)方法預(yù)測mi RNA的靶基因,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測的方法驗(yàn)證它們的靶向調(diào)控關(guān)系;3.利用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)方法在喉鱗癌/癌旁正常黏膜新鮮標(biāo)本、石蠟標(biāo)本和細(xì)胞株中的觀察hsa-miR-301a-3p和靶基因Smad4表達(dá)情況;4.將hsa-miR-301a-3p和Smad4表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)、術(shù)后隨訪資料相結(jié)合,評(píng)價(jià)它們的臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系;5.采用功能獲得和功能缺失的實(shí)驗(yàn)方法將構(gòu)建Smad4過表達(dá)載體和商品化的hsa-miR-301a-3p抑制物轉(zhuǎn)染至喉鱗癌細(xì)胞,通過MTS法、EdU法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell法、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)手段,觀察它們對(duì)喉鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響;6.采用westernblot方法觀察hsa-mir-301a-3p和smad4對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵分子的作用;7.采用spss20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。研究結(jié)果1.從microrna表達(dá)譜中篩選出上調(diào)表達(dá)的hsa-mir-301a-3p作為研究對(duì)象;2.利用生物信息學(xué)方法預(yù)測出smad4為hsa-mir-301a-3p的靶基因,成功構(gòu)建smad4的野生型和突變型3’-utr,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果證實(shí)它們確實(shí)存在靶向調(diào)控關(guān)系;3.在喉鱗癌/癌旁正常黏膜新鮮標(biāo)本、石蠟標(biāo)本和細(xì)胞株中,hsa-mir-301a-3p表達(dá)量增高,smad4表達(dá)量降低;4.hsa-mir-301a-3p表達(dá)與喉鱗癌患者的t分期相關(guān),smad4表達(dá)與喉鱗癌患者的分化程度、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān);5.hsa-mir-301a-3p與smad4兩者之間呈負(fù)相關(guān)性;6.hsa-mir-301a-3p低表達(dá)或smad4高表達(dá)的喉鱗癌患者預(yù)后較好,smad4低表達(dá)伴hsa-mir-301a-3p高表達(dá)的喉鱗癌患者預(yù)后不良;7.抑制hsa-mir-301a-3p表達(dá)或恢復(fù)smad4表達(dá)可顯著抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖、克隆、遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞于g0/g1期;8.hsa-mir-301a-3p和smad4的表達(dá)失調(diào)可引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中重要分子變化。研究結(jié)論1.喉鱗狀細(xì)胞癌中存在差異性microrna表達(dá)譜;2.smad4是hsa-mir-301a-3p的靶基因,hsa-mir-301a-3p對(duì)smad4存在靶向調(diào)控作用;3.hsa-mir-301a-3p在喉鱗癌中表達(dá)上調(diào),起到癌基因作用,對(duì)于喉鱗癌細(xì)胞增殖、克隆、遷移和侵襲有促進(jìn)作用,對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用,轉(zhuǎn)染其抑制劑后可將細(xì)胞周期阻滯于g0/g1期;4.smad4在喉鱗癌中表達(dá)下調(diào),起到抑癌基因作用,對(duì)于喉鱗癌細(xì)胞增殖、克隆、遷移和侵襲有抑制作用,對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用,可將細(xì)胞周期阻滯于g0/g1期;5.Hsa-miR-301a-3p高表達(dá)同時(shí)伴有Smad4低表達(dá)的患者預(yù)后不良;6.Hsa-miR-301a-3p—Smad4參與了喉鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程;7.Hsa-miR-301a-3p通過調(diào)控其靶基因Smad4參與了喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移,為今后喉鱗癌的早期診斷、早期治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的分子標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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