第一部分OSA動物模型構(gòu)建與心臟功能的評估目的:睡眠呼吸暫停低通氣綜合征是指各種病因?qū)е碌拿客硭哌^程中呼吸暫停反復(fù)發(fā)作30次以上或睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)≥5次/小時伴有白天嗜睡等臨床癥狀,以阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSA)最為常見。關(guān)于OSA的發(fā)病機制和并發(fā)癥的研究,國內(nèi)外主要是將小鼠、大鼠等小動物暴露于間歇性低氧環(huán)境中,從病理生理機制上模擬OSA造成的間歇性低氧。本部分研究的目的就是建立OSA動物模型并評估模型鼠的心臟功能。方法:購買C57-BL/6J雄性小鼠,利用我們前期設(shè)計的間斷低氧培養(yǎng)箱(專利號:ZL 2014 2 0484878.2)進行模型的構(gòu)建,間斷低氧設(shè)置:每分鐘60個循環(huán),其中用5s的時間將容器中的氧濃度下降到5%,繼而維持20s;隨后40s通入空氣,將氧濃度上調(diào)到21%,每天持續(xù)8小時。陰性對照組的小鼠也置入同樣的容器中,在同樣的8小時中維持常氧。模型建立時間為3個月。利用心臟彩超檢測各組小鼠的心功能,HE染色檢測心臟組織切片的大體結(jié)構(gòu),Masson染色、天狼星紅染色檢測膠原蛋白的表達,免疫組織化學(xué)染色檢測Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達。結(jié)果:3個月后我們發(fā)現(xiàn):(1)二維超聲圖像顯示,相對于對照組,IH組并沒有改變小鼠心臟舒張期室間隔厚度和左心室舒張末期直徑(p0.05),但是左心室的收縮末期直徑增大(p0.05)和左心室后壁舒張末期的厚度變薄(p0.05)而且IH組的小鼠心臟功能(LVEF、FS、E/A、E’/A’)下降(p均0.01);(2)HE染色顯示,相對于對照組,IH組小鼠心臟微血管的管壁厚度(IMT)與管腔直徑的比值增大(p0.05);(3)Masson染色和天狼星紅染色示,相對于對照組,IH組的小鼠的心臟微血管的管壁和周圍膠原沉積水平明顯增高(p0.05);(4)免疫組織化學(xué)染色顯示,相對于空白組,IH組的Collagen Ⅰ的表達量明顯增高(p0.05),但是并沒有增加Collagen Ⅲ的表達量(p0.05)。結(jié)論:OSA可以導(dǎo)致心功能下降和心臟微血管纖維化第二部分PHD3改善OSA導(dǎo)致的心臟纖維化目的:目前臨床上治療OSA的唯一有效方法為持續(xù)氣道正壓通氣(CPEP),然而有研究認為CPEP不能改善OSA合并心衰患者的住院率、生活質(zhì)量也不能改善OSA合并心臟病患者的預(yù)后和死亡,所以必須尋找一個新的作用靶點來改善OSA導(dǎo)致的心臟纖維化,從而聯(lián)合CPEP治療來改善病人的住院率和生活質(zhì)量。脯氨酸羥化酶3(PHD3)是一種細胞氧感受器,主要表達在神經(jīng)元、心肌及肌肉組織。研究顯示PHD3的功能具有兩面性:一方面,常氧狀態(tài)下,PHD3的表達增加導(dǎo)致細胞凋亡,而另一方面,在低氧狀態(tài)下,PHD3的高表達可以促進細胞的存活和增殖并且對心肌缺血反應(yīng)有至關(guān)重要的調(diào)控作用。然而PHD3是否對OSA導(dǎo)致的心臟微血管纖維化有保護或者損傷作用,目前尚無相關(guān)報道。本部分研究旨在探索PHD3在OSA導(dǎo)致的心臟微血管纖維化中的作用。方法:具體實驗方法包括:慢病毒(干擾和過表達)的構(gòu)建和感染;心臟彩超檢測各組小鼠的心功能;HE染色檢測心臟組織切片的大體結(jié)構(gòu),Masson染色、天狼星紅染色檢測膠原蛋白的表達;免疫組織化學(xué)染色檢測Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達。結(jié)果:(1)過表達PHD3(Lv PHD3)的表達可以明顯改善左心室的收縮末期直徑(p0.05)、左心室后壁舒張末期的厚度(p0.05)和小鼠的心臟功能:LVEF(p0.05);FS(p0.05);E/A(p0.01);E’/A’(p0.01)。然而干擾PHD3(sh PHD3)的表達并不能改善上述的心臟指標(biāo)(p0.05);(2)HE染色示:相對于Lv NC組,Lv PHD3組小鼠心臟微血管的管壁厚度(IMT)與管腔直徑的比值有所改善(p0.05);(3)Masson染色和天狼星紅染色檢測示:相對于Lv NC組,我們發(fā)現(xiàn)Lv PHD3組的小鼠的心臟微血管的管壁和周圍膠原沉積水平明顯降低(p均0.05),然而sh PHD3不改變間斷低氧導(dǎo)致的纖維化(p0.05);(4)免疫組織化學(xué)染色顯示,相對于Lv NC組,Lv PHD3組的Collagen Ⅰ的表達量明顯降低(p0.05),然而并沒有改變Collagen Ⅲ的表達量(p0.05),有意思的是sh PHD3不改變間斷低氧引起的Collagen Ⅰ表達升高(p0.05)。結(jié)論:PHD3可以改善OSA引起的心臟功能異常和心臟纖維化。第三部分PHD3通過改善內(nèi)皮細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而改善心臟微血管的纖維化目的:2007年,Zeisberg.EM等人首次報道了心臟纖維化與內(nèi)皮細胞來源的成纖維細胞的出現(xiàn)密切相關(guān),提示在心臟纖維化過程中發(fā)生了內(nèi)皮間充質(zhì)化(End MT),而且內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的心臟纖維化的位置往往發(fā)生在心臟血管的管周和內(nèi)皮下。第一部分研究發(fā)現(xiàn),OSA導(dǎo)致的心臟纖維化主要發(fā)生在心臟微血管的中層和管周。第二部分研究發(fā)現(xiàn),過表達PHD3可以明顯降低OSA導(dǎo)致的小鼠心臟微血管纖維化水平,并改善小鼠的心功能,然而機制并不清楚。因此我們推測:PHD3的過表達很可能通過抑制End MT的發(fā)生從而改善OSA相關(guān)的心臟纖維化。該部分研究目的旨在探索PHD3改善OSA導(dǎo)致心臟纖維化的機制。方法:具體方法包括:小鼠體內(nèi)實驗免疫組織化學(xué)檢測CD31和α-SMA;WB檢測PHD3、Twist、Snail、CD31、α-SMA、VE-cadherin、FSP 1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達;細胞免疫熒光染色檢測CD31、α-SMA、HIF-1α、p-smad2/3、smad2/3;Transwell檢測內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)化的內(nèi)皮細胞的遷移能力。結(jié)果:(1)體內(nèi)實驗證實間斷缺氧(IH)導(dǎo)致End MT:免疫組織化學(xué)染色示,control組的CD31染僅僅表達于血管內(nèi)膜,而IH組的CD31的表達出現(xiàn)了一定程度的彌散,即IH組的CD31不僅僅表達在微血管的內(nèi)膜上,還在血管中膜有一定程度的表達,control組α-SMA僅僅表達于微血管的中膜,在內(nèi)膜并沒有表達,而IH組的α-SMA不僅表達于微血管的中膜,同時在內(nèi)膜也有了一定的表達。Wb顯示,相對于control組,IH組的snail和twist(End MT激活的相關(guān)基因)表達明顯升高(p均0.05);(2)體內(nèi)實驗PHD3可以改善IH導(dǎo)致的End MT:免疫組化示,Lv PHD3可以極大的改善IH導(dǎo)致的CD31的彌散表達和α-SMA的內(nèi)膜表達。Wb顯示相對于Lv NC組,Lv PHD3組的snail和twist的表達量明顯降低(p均0.05);(3)體外實驗IH誘導(dǎo)End MT:免疫熒光示,control組的細胞僅僅表達內(nèi)皮細胞標(biāo)志物CD31,而對于間充質(zhì)細胞或者肌成纖維細胞表型的標(biāo)志物α-SMA則幾乎不表達,經(jīng)過72h的間斷低氧后,IH組的CD31表達有下降的趨勢,而α-SMA的表達明顯升高。Wb示相對于control組,IH組的snail和twist的基因表達明顯升高(p均0.05);(4)體外實驗PHD3改善IH誘導(dǎo)的End MT:Wb示,相對于control組,IH組可以升高間充質(zhì)細胞標(biāo)志物/肌成纖維細胞標(biāo)志物α-SMA和FSP 1的表達(p均0.01),并降低內(nèi)皮細胞標(biāo)志物CD31和VE-Cadherin(p均0.01)的表達。Lv PHD3可以改善IH導(dǎo)致的上述指標(biāo)的改變(p均0.01)。為了進一步證明上述結(jié)果snail和twist的表達被檢測,wb示相對于Lv NC組,Lv PHD3組的snail和twist的表達量明顯降低(p均0.05);(5)PHD3改善間充質(zhì)化內(nèi)皮導(dǎo)致的遷移能力和膠原分泌能力的增強:Transwell示,相對于control組,IH導(dǎo)致的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細胞遷移能力明顯增強(p0.05),而Lv PHD3可以改善內(nèi)皮細胞間充質(zhì)化導(dǎo)致的遷移能力增強(p0.05)。為進一步探索細胞功能的改變,我們利用wb來檢測內(nèi)皮細胞分泌膠原的能力,wb示,相對于control組,IH組的細胞分泌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的能力明顯增強(p均0.01),而Lv PHD3可以改善End MT導(dǎo)致的Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ分泌能力增強(p均0.01);(6)PHD3可通過調(diào)節(jié)HIF-1α改善IH誘導(dǎo)的End MT:Wb示相對于control組,IH組的HIF-1α表達量明顯的升高(p0.05),然而Lv PHD3可以改善IH造成的HIF-1α表達升高(p0.05)。免疫熒光示control組的HIF-1α主要表達于細胞質(zhì),少部分表達于細胞核,而IH組的HIF-1α主要表達于細胞核中,Lv PHD3可以抑制IH導(dǎo)致的HIF-1α核轉(zhuǎn)位;(7)PHD3可通過調(diào)節(jié)Smad2/3改善IH誘導(dǎo)的End MT:免疫熒光示control組的p-smad2/3僅僅表達在細胞質(zhì)中,smad2/3大部分表達于細胞質(zhì)中少部分表達于細胞核中,而IH組的p-smad2/3和smad2/3出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)位,Lv PHD3可以抑制IH導(dǎo)致的p-smad2/3和smad2/3核轉(zhuǎn)位,為了進一步驗證我們的結(jié)論,利用smad2/3的抑制劑來抑制p-smad2/3的活性。加入抑制劑阻斷smad2/3后,wb示相對于IH組,CD31的表達升高(p0.05),α-SMA(p0.05)、snail(p0.01)、twist(p0.01)的表達降低。結(jié)論:(1)PHD3通過改善內(nèi)皮細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而改善心臟微血管的纖維化;(2)PHD3改善IH導(dǎo)致的End MT與降解和滅活HIF-1α有關(guān);(3)PHD3改善IH導(dǎo)致的End MT與滅活p-smad2/3有關(guān)。第四部分PHD3通過改善平滑肌去分化從而改善心臟微血管的纖維化目的:本研究的第三部分認為PHD3通過抑制End MT的發(fā)生從而改善OSA導(dǎo)致的心臟纖維化。有研究推測,內(nèi)皮細胞來源的肌成纖維細胞所占到的比例高達30%,也就是說還有其他來源肌成纖維細胞。體內(nèi)實驗我們利用慢病毒來干擾和過表達小鼠心臟的PHD3表達水平,然而慢病毒在感染心臟時并沒有特異性,所以PHD3改善OSA導(dǎo)致的心臟纖維化可能不僅僅作用于內(nèi)皮細胞。研究表明血管平滑肌細胞(VSMC)具有表型轉(zhuǎn)化的功能,VSMC的過度增殖和膠原的分泌可能是血管管腔狹窄的一個重要的原因。本研究第一部分發(fā)現(xiàn),OSA導(dǎo)致的心臟纖維化主要發(fā)生在心臟微血管的中層和管周,所以我們推測PHD3改善OSA導(dǎo)致的心臟纖維化可能與心臟血管的VSMC有關(guān)。該部分研究目的旨在進一步探索PHD3改善OSA導(dǎo)致心臟纖維化的機制。方法:具體方法包括:體內(nèi)實驗免疫組織化學(xué)檢測OPN和α-SMA;WB檢測PHD3、α-SMA、OPN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達;細胞免疫熒光染色檢測α-SMA、HIF-1α;si RNA的制備和轉(zhuǎn)染;RT-q PCR檢測HIF-1αm RNA水平。結(jié)果:(1)體內(nèi)實驗證實IH導(dǎo)致平滑肌去分化:免疫組織化學(xué)染色示,control組心臟微血管的中層幾乎不表達OPN,而IH組的心臟微血管中層的OPN表達明顯升高(p0.01),相對于control組,IH組的α-SMA的表達幾乎沒有變化(p0.05);(2)體內(nèi)實驗證實PHD3改善IH導(dǎo)致的平滑肌去分化:免疫組化示,相對于Lv NC組,Lv PHD3可以明顯的改善IH導(dǎo)致的心臟微血管中層的OPN表達升高(p0.01);(3)體外實驗證實IH導(dǎo)致平滑肌去分化:免疫熒光示,空白組的細胞僅僅表達收縮型標(biāo)志物α-SMA,而對于合成表型的標(biāo)志物則幾乎不表達,72h的間斷低氧后,IH組的平滑肌細胞開始表達合成型的標(biāo)志物OPN。(4)體外實驗證實PHD3改善IH導(dǎo)致的平滑肌去分化:Wb結(jié)果顯示,相對于control組,IH組可以明顯的升高合成型細胞標(biāo)志物OPN的表達(p0.05),并降低收縮型標(biāo)志物α-SMA的表達(p0.01)而Lv PHD3可以改善IH導(dǎo)致的OPN表達升高(p0.05)和α-SMA的表達降低(p0.01);(5)PHD3改善平滑肌去分化導(dǎo)致的膠原分泌增強:Wb示相對于control組,IH組的細胞分泌Collagen Ⅰ的能力明顯增強(p0.05),然而并不能改變Collagen Ⅲ的分泌能力(p0.05),Lv PHD3可以明顯的改善平滑肌去分化導(dǎo)致的Collagen Ⅰ分泌能力增強(p0.05);(6)PHD3通過抑制和滅活HIF-1α改善IH導(dǎo)致的平滑肌去分化:RT-q PCR示相對于control組IH組沒有改變HIF-1αm RNA的水平,而sh PHD3和Lv PHD3也沒有改變HIF-1αm RNA的水平(p均0.05)。Wb示,相對于control組,IH組的HIF-1α表達量明顯的升高(p0.01),然而Lv PHD3可以改善IH造成的HIF-1α表達升高(p0.01)。免疫熒光示,control組的HIF-1α主要表達于細胞質(zhì),少部分表達于細胞核,而IH組的HIF-1α則產(chǎn)生了明顯的核轉(zhuǎn)位,Lv PHD3可以有效抑制IH導(dǎo)致的HIF-1α核轉(zhuǎn)位。為進一步驗證上述結(jié)果,我們利用小干擾來干擾HIF-1α的表達,wb示,si HIF-1α組能很好的改善IH導(dǎo)致平滑肌去分化導(dǎo)致的α-SMA表達降低和OPN的表達升高(p均0.05)。結(jié)論:(1)PHD3通過改善平滑肌細胞的去分化從而改善心臟微血管的纖維化;(2)PHD3改善IH導(dǎo)致的平滑肌去分化與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的HIF-1α有關(guān)。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R766;R54
【部分圖文】：

東南大學(xué)博士學(xué)位論文26三 結(jié) 果1. CIH 動物模型的制備示意圖利用既往已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利的慢性間歇缺氧動物培養(yǎng)箱進行造模（圖1）。并對培養(yǎng)箱內(nèi)的氧濃度進行實時監(jiān)測。圖 1：小鼠間斷低氧培養(yǎng)箱及控制面板2. 心臟彩超示 CIH 影響心臟功能間斷低氧 3 個月后，給與小鼠行超聲心動圖檢查。二維超聲圖像顯示，相對于對照組，IH 組并沒有改變小鼠心臟舒張期室間隔厚度和左心室舒張末期直徑（p>0.05，圖 2A2b1b2）。但是相對于對照組，左心室的收縮末期直徑增大（2.8±0.2 VS 1.89±0.17 p<0.05，圖 2A2b3）和左心室后壁舒張末期的厚度變�。�0.77±0.06 VS 0.89±0.03 p<0.05，圖 2A2b4）。相對于對照組，IH 組的小鼠心臟功能有所下降：LVEF（53.67±3.1% VS 75.67±4.1% p<0.01，圖 2A2b5）；FS（25±2% VS 39.3±2.1% p<0.01

圖 2 IH 損傷小鼠心臟功能。A 典型的心臟彩超二維圖、M 超圖、PW 圖和組織多普勒圖。B心臟彩超各個數(shù)據(jù)的半定量分析 b1 IVSD；b2 LVIDD；b3 LVIDs；b4 LVPWd；b5 LVEF%；b6 FS%；b7 E/A; b8 E’/A’ 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，n=8/每組，*p<0.05 VS control**p<0.01 VS control3. 組織病理學(xué)示 CIH 導(dǎo)致心臟微血管重構(gòu)和心臟纖維化間斷低氧 3 個月后，給與小鼠心臟組織病理學(xué)染色。HE 染色顯示，相對于對照組，IH 組小鼠心臟微血管的管壁厚度（IMT）與管腔直徑的比值增大（0.23±0.03 VS 0.14±0.02 p<0.05，圖 3A3b1）。然后我們利用 Masson 染色和天狼星紅染色檢測小鼠心臟的膠原水平，相對于對照組我們發(fā)現(xiàn) IH 組的小鼠的心臟微血管的管壁和周圍膠原沉積水平明顯增高，半定量分析增高了約 2.05 倍（Masson 染色）（0.37±0.07 VS 0.18±0.05 p<0.05，圖 3A3b2）和 1.84 倍（天狼星

然后我們對膠原表達部位進行了分析，我們發(fā)現(xiàn)膠原的表達量增高的部位集中于心臟微血管的管壁和管周（圖 3），而心肌以及心肌間隙中并沒有表達過多的膠原（圖 4）。也就是說長時間的間斷低氧僅僅能導(dǎo)致心臟微血管的重構(gòu)而不能導(dǎo)致心肌以及心肌間隙的膠原沉積。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 YU Fu-Chao;XU Yan-Juan;TONG Jia-Yi;LU Zhou-Zhou;ZHANG Xiao-Hui;;Therapeutic effects of Qishen Yiqi Dropping Pill on myocardial injury induced by chronic hypoxia in rats[J];Chinese Journal of Natural Medicines;2015年10期

本文編號：2821868