發(fā)布時間：2020-09-17 12:14

　　 目的:體外提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源性微囊泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles,hUCMSCs-MVs)并觀察hUCMSCs-MVs對糖尿病大鼠糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷(diabetic retinal neurodegeneration,DRN)的作用及機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)分3部分,第1部分進(jìn)行hUCMSCs傳代培養(yǎng),收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,利用超速離心法提取hUCMSCs-MVs,流式細(xì)胞儀、透射電鏡等研究方法對hUCMSCs-MVs進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)表型鑒定;第2部分為體外實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為4組:A組為正常對照組,B組高糖培養(yǎng)組(RGCs培養(yǎng)基內(nèi)含濃度為33 mmol/L葡萄糖),C組為正常RGCs與hUCMSC-MVs共培養(yǎng)組,D組為高糖環(huán)境下RGCs與hUCMSC-MVs共培養(yǎng)組。通過免疫抗體包被篩選法及免疫熒光雙染法對原代SD大鼠視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)進(jìn)行分離及鑒定,觀察hUCMSCs-MVs與RGCs的內(nèi)化過程,CCK-8法、膜聯(lián)蛋白-碘化丙啶(AnnexinV-PI)法、實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time time-reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot,WB)等測定hUCMSCs-MVs對各組RGCs的活性及凋亡的影響及各組細(xì)胞內(nèi)B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bax、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3基因水平及蛋白水平的相對表達(dá)量;第3部分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為4組:A組為正常對照組、B組為DM對照組、C組為正常對照+hUCMSCs-MVs玻璃體腔注射組、D組為DM+hUCMSCs-MVs玻璃體腔注射組。實(shí)驗(yàn)方法為腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型,建模成功后8周各組行玻璃體腔內(nèi)注射hUCMSCs-MVs,注射后觀察時間為4周。利用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察內(nèi)層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變,原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)觀察DR大鼠內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況,免疫熒光雙染法定性及定位磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)情況,WB法測量目的蛋白JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、裂解Caspase-3(Cleaved Caspase-3)的相對表達(dá)量。結(jié)果:成功提取hUCMSCs-MVs,通過透射電子顯微鏡及流式細(xì)胞儀對hUCMSCs-MVs進(jìn)行形態(tài)及免疫學(xué)鑒定,觀察到hUCMSCs-MVs直徑介于10~2-10~3nm,為圓形膜性囊泡樣結(jié)構(gòu),高表達(dá)hUCMSCs特異性蛋白CD44、CD29、CD73、CD105,陰性表達(dá)整合素(integrin,CD49f)、HLA class II(HLA-DR)及造血干細(xì)胞特異標(biāo)記蛋白CD34、CD45。hUCMSCs-MVs的分泌效率為接種密度約1×10~5/ml、第2代-第4代(P2-P4)hUCMSCs培養(yǎng)上清液約300ml可提取蛋白質(zhì)量約342.65?1.32μg的hUCMSCs-MVs。成功完成原代SD大鼠RGCs體外培養(yǎng)及鑒定,證明體外RGCs可與hUCMSCs-MVs良好內(nèi)化。CCK-8及AnnexinV/PI雙染法檢測結(jié)果顯示,B組細(xì)胞活性低于A、C、D組,B組細(xì)胞凋亡率高于A、C、D組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。RT-PCR及WB檢測結(jié)果顯示,B、D組RGCs、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于A、C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SNK-q組間比較結(jié)果顯示D組RGCs內(nèi)Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于B組,B組Bax、Caspase-3及Cleaved-Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于D組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STZ誘導(dǎo)建立DM大鼠模型,建模成功8周后大鼠視網(wǎng)膜切片HE染色可見糖尿病性視網(wǎng)膜病變;玻璃體腔注射hUCMSCs-MVs后4周,觀察4組大鼠內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度改變,4組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SNK-q檢驗(yàn)示B組內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度低于其余3組,D組視網(wǎng)膜厚度高于B組。4組大鼠內(nèi)層視網(wǎng)膜TUNEL染色陽性(TUNEL~+)細(xì)胞表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SNK-q檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示B組大鼠內(nèi)層視網(wǎng)膜內(nèi)TUNEL~+細(xì)胞表達(dá)率高于其余各組,D組內(nèi)層視網(wǎng)膜內(nèi)TUNEL~+細(xì)胞表達(dá)率低于B組。免疫熒光定位結(jié)果顯示早期DR大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)JNK的活化主要內(nèi)層視網(wǎng)膜GCL,merge熒光融合后可見表達(dá)于RGCs胞漿內(nèi)。4組間視網(wǎng)膜p-JNK陽性(p-JNK~+)表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SNK-q檢驗(yàn)結(jié)果顯示B組大鼠內(nèi)層視網(wǎng)膜內(nèi)p-JNK~+表達(dá)率高于其余各組,D組GCL內(nèi)的p-JNK~+表達(dá)率低于B組。WB結(jié)果顯示4組間目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SNK-q檢驗(yàn)結(jié)果顯示B組Bcl-2相對表達(dá)量低于其余3組,B組JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相對表達(dá)量高于其余3組,D組JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相對表達(dá)量高于D組。結(jié)論:體外hUCMSCs-MVs可通過降低高糖環(huán)境下RGCs凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮對高糖環(huán)境下RGCs損傷的保護(hù)作用;玻璃體腔注射hUCMSCs-MVs可通過增加視網(wǎng)膜內(nèi)Bcl-2表達(dá)、降低JNK/Bax/Caspase-3的表達(dá)及活化,降低早期DR大鼠RGCs凋亡及內(nèi)層視網(wǎng)膜萎縮,發(fā)揮對DRN的保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R774.1
【部分圖文】：

1：A-D 為光學(xué)顯微鏡下觀察 hUCMSCs 細(xì)胞傳代培養(yǎng)后 1d、3d、5d、7d 的細(xì)胞 1d 細(xì)胞基本貼壁，3-5d 細(xì)胞成長梭形或多角形，7d 細(xì)胞融合率為 80%（×200）.2 繪制 hUCMSCs 細(xì)胞生長動力曲線依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)及細(xì)胞吸光度值 A 繪制的細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞接種天處于不同生長時期，即生長緩慢的潛伏期、斜率較大的生長期、呈平頂期。從生長曲線觀察，1-3 天 A 值緩慢增加，細(xì)胞呈現(xiàn)緩慢生長，為的潛伏期。3-5 天吸光度 A 值曲線斜率增加，細(xì)胞生長迅速，為細(xì)胞對。5 天后細(xì)胞生長曲線變得平坦，即細(xì)胞生長緩慢，為細(xì)胞增殖穩(wěn)定期取 hUCMSCs 細(xì)胞穩(wěn)定期即培養(yǎng) 5-7 天 的 hUCMSCs 培 養(yǎng)基MSCs-MVs（圖 1.2）。

圖 1.2：hUCMSCs 細(xì)胞生長曲線圖，X 軸為培養(yǎng)時間（天），Y 軸為吸光度（A）1.2.3 hUCMSCs-MVs 形態(tài)學(xué)鑒定透射電子顯微鏡下觀察 hUCMSCs-MVs，可見 3%磷鎢酸負(fù)染背景hUCMSCs-MVs 為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結(jié)構(gòu)，未見雙凹圓盤狀構(gòu)，顆粒膜結(jié)構(gòu)完整，直徑約為（102-103）nm，流式細(xì)胞儀檢測可hUCMSCs-MVs 顆粒峰值主要位于（102-103）nm 直徑范圍（圖 1.3）。圖 1.3： hUCMSCs-MVs 透射電子顯微鏡像及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：透射電子顯微鏡像

圖 1.2：hUCMSCs 細(xì)胞生長曲線圖，X 軸為培養(yǎng)時間（天），Y 軸為吸光度（A）1.2.3 hUCMSCs-MVs 形態(tài)學(xué)鑒定透射電子顯微鏡下觀察 hUCMSCs-MVs，可見 3%磷鎢酸負(fù)染背景下hUCMSCs-MVs 為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結(jié)構(gòu)，未見雙凹圓盤狀結(jié)構(gòu)，顆粒膜結(jié)構(gòu)完整，直徑約為（102-103）nm，流式細(xì)胞儀檢測可見hUCMSCs-MVs 顆粒峰值主要位于（102-103）nm 直徑范圍（圖 1.3）。

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本文編號：2820706