發(fā)布時間：2020-09-19 09:22

　　 目的:阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)是以睡眠中上氣道反復(fù)塌陷為特征的綜合癥,最終導(dǎo)致慢性間歇低氧和睡眠障礙。OSAHS最主要的病理生理過程是慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH),可以引起多臟器功能損傷,其中OSAHS引起的腦損傷是近期人們關(guān)注的熱點(diǎn)。OSAHS與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān),例如中風(fēng)、脊髓損傷以及神經(jīng)退行性變,這提示OSAHS可能在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而,這些機(jī)制并不完全清楚。有文獻(xiàn)報道OSAHS可以導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生及腦水腫等,結(jié)構(gòu)的改變必然導(dǎo)致神經(jīng)功能的異常。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的主要支持營養(yǎng)細(xì)胞,支持神經(jīng)細(xì)胞存活。因此靶向抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞向促炎表型的轉(zhuǎn)化,可能為腦損傷提供神經(jīng)保護(hù)作用。水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)是腦內(nèi)重要的水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,不僅調(diào)控病理和生理狀態(tài)下腦水平衡,而且與神經(jīng)炎癥有著密切的關(guān)系�？紤]到CIH可以引起腦水腫,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,而且AQP4主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上,我們推測AQP4的表達(dá)變化可能與CIH造成的腦損傷相關(guān),目前尚無CIH誘導(dǎo)腦損傷與AQP4的相關(guān)報道。p38MAPK信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥方面發(fā)揮重要作用,可能參與調(diào)節(jié)了星形膠質(zhì)細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)功能。p38 MAPK信號通路的激活與星形膠質(zhì)細(xì)胞中AQP4的表達(dá)也密切相關(guān)。以往的研究表明,p38MAPK通路參與IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的AQP4表達(dá),從而影響創(chuàng)傷性腦損傷后的腦水腫。MAPK家族在各種低氧環(huán)境下有選擇性的被激活,CIH/OSAHS激活了p38MAPK信號通路,可造成海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷。綜上我們推測CIH誘發(fā)的腦損傷,可能與p38MAPK的活化及AQP4的表達(dá)相關(guān),目前尚無報道,有待進(jìn)一步研究。姜黃素(curcumin)是在植物姜黃中發(fā)現(xiàn)的一種天然多酚化合物,發(fā)揮著抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用,并且姜黃素可以穿透血腦屏障,對神經(jīng)系統(tǒng)具有很好的保護(hù)作用。近期研究顯示姜黃素在腦外傷,腦缺血再灌注,腦出血及COPD等多種腦損傷模型中通過調(diào)控AQP4的表達(dá)減輕腦水腫。也有文獻(xiàn)報道,姜黃素影響星形膠質(zhì)細(xì)胞中p38通路的活化,目前姜黃素在CIH相關(guān)腦損傷的作用機(jī)制尚不清楚。因此我們推測AQP4和p38 MAPK信號通路可能參與了姜黃素在CIH誘導(dǎo)的腦損傷中的保護(hù)作用,這些都有待進(jìn)一步證實。本研究旨在通過體內(nèi)實驗?zāi)MOSAHS/CIH的低氧特點(diǎn),建立CIH小鼠模型,動態(tài)觀察CIH致小鼠腦損傷的炎癥反應(yīng)及病理生理學(xué)變化特點(diǎn),評價姜黃素對CIH相關(guān)腦損傷的保護(hù)作用,從而探討p38MAPK信號通路及AQP4是否參與姜黃素對CIH腦損傷保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制;并且通過體外實驗建立原代星形膠質(zhì)細(xì)胞模型,進(jìn)一步研究p38 MAPK/AQP4信號通路在低氧所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用及姜黃素的保護(hù)機(jī)制,從而驗證姜黃素對CIH小鼠腦損傷的保護(hù)作用是否部分是通過調(diào)節(jié)p38MAPK/AQP4通路的活性來實現(xiàn)的。方法:1、CIH致小鼠腦損傷的動態(tài)觀察SPF級Balb/c小鼠144只,按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為常氧對照組(control,n=72),慢性間歇低氧組(CIH,n=72),CIH動物被放置在低氧艙中,低氧艙的模式設(shè)置為5%-21%氧濃度交替給予,每180秒為1個循環(huán),包括維持低氧50秒及常氧50秒,這種循環(huán)模式相當(dāng)于每小時20次低氧-復(fù)氧單循環(huán),最低氧濃度達(dá)到5%,每天連續(xù)進(jìn)行8小時(from9:00a.m.to 5:00 p.m.),分別觀察0W、4W、8W及10W。在觀察點(diǎn)結(jié)束時,觀察小鼠的一般狀態(tài),體重及腦濕干比重變化,利用皮質(zhì)酮檢測試劑盒檢測血清皮質(zhì)酮濃度,通過ELISA法檢測腦組織中TNF-α,IL1-β含量,觀察小鼠腦皮質(zhì)HE染色,TUNEL染色評價神經(jīng)元細(xì)胞損傷及凋亡程度,利用GFAP免疫組化染色比較星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及GFAP表達(dá)量改變,通過上述指標(biāo)系統(tǒng)分析CIH小鼠腦損傷的動態(tài)演變特點(diǎn)。2、姜黃素在CIH致小鼠腦損傷中的作用及機(jī)制研究雄性SPF級Balb/c小鼠90只,按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分成5組(n=18):常氧對照組(Control),慢性間歇低氧組(CIH),50mg/kg姜黃素治療組[CIH+Cur(50mg/kg)],100mg/kg姜黃素治療組[CIH+Cur(100 mg/kg)]和200mg/kg姜黃素治療組[CIH+Cur(200 mg/kg)]。按照第一部分方法制備CIH小鼠模型,小鼠連續(xù)間歇低氧10W。各CIH組在每日間歇低氧前分別接受了不同劑量的姜黃素(0,50,100,or200mg/kg,灌胃法)。在觀察點(diǎn)結(jié)束時,通過觀察小鼠的一般狀態(tài),體重及腦濕干比重變化,利用皮質(zhì)酮檢測試劑盒檢測血清皮質(zhì)酮濃度,通過ELISA法檢測腦組織中TNF-α,IL1-β含量,觀察小鼠腦皮質(zhì),腦干及小腦各部位HE染色,TUNEL染色,評價神經(jīng)元細(xì)胞損傷及凋亡程度,利用GFAP免疫組化染色比較星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及GFAP表達(dá)量變化,通過上述指標(biāo)評價姜黃素對CIH致腦損傷的保護(hù)作用。再此基礎(chǔ)上,通過Western Blot及qPCR方法從蛋白水平,基因水平檢測腦組織AQP4的表達(dá)變化,及利用Western Blot方法檢測p38MAPK信號通路關(guān)鍵分子包括MKK3,p-MKK3,MKK6,p-MKK6,p38MAPK,p-p38MAPK及CHOP的表達(dá)變化,進(jìn)一步探討AQP4及p38MAPK通路是否參與了姜黃素對CIH腦損傷的保護(hù)機(jī)制。此外通過免疫熒光雙染觀察腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞上AQP4及p-p38MAPK表達(dá)變化的相關(guān)性。3、p38 MAPK/AQP4信號通路在低氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用及姜黃素的保護(hù)機(jī)制采用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞作為細(xì)胞模型。首先對原代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離、純化及鑒定。免疫熒光染色GFAP檢測細(xì)胞純度,純度90%可用于后續(xù)實驗。實驗分為常氧組和低氧組,常氧組包括常氧對照組、常氧+姜黃素組和常氧+p38抑制劑組;低氧組包括低氧對照組、低氧+姜黃素組、低氧+p38抑制劑組。根據(jù)分組對細(xì)胞分別進(jìn)行加藥及低氧處理(1%O2)。3h培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。利用LDH試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量,評估細(xì)胞損傷程度。通過免疫熒光雙染,Western Blot及qPCR方法從蛋白水平,基因水平評估星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)變化,利用免疫熒光雙染,Western Blot檢測p38MAPK,p-p38MAPK蛋白表達(dá)變化。通過比較AQP4,p38MAPK及p-p38MAPK表達(dá)變化,進(jìn)一步探討姜黃素對低氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中p38 MAPK信號通路活性及AQP4表達(dá)的影響及二者相互關(guān)系的驗證。結(jié)果:1、CIH對小鼠腦損傷的動態(tài)演變特點(diǎn)利用低氧倉進(jìn)行間歇低氧,成功建立小鼠CIH腦損傷模型。在0W、4W、8W及10W不同時間點(diǎn),CIH小鼠呈現(xiàn)了不同的特征。小鼠精神萎靡,對外界刺激的反應(yīng)明顯遲鈍。對抗外界阻力能力減弱,懶動,隨著CIH時間延長而加重。4W、8W及10W組CIH小鼠體重與同周齡小鼠比較均明顯下降(P0.05);血清皮質(zhì)酮濃度及腦組織炎癥因子TNF-α,IL1-β含量有逐漸上升趨勢(P0.05),在8周達(dá)到高峰,10周與8周比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。腦濕干比重隨著CIH時間延長逐漸升高,4W與對照組無顯著差異(P0.05),8W,10W差異明顯(P0.05),且10W達(dá)到腦水腫高峰。通過HE染色,我們可以觀察到常氧對照組正常的神經(jīng)元結(jié)構(gòu),有清晰的細(xì)胞核及核仁,而在CIH組,隨著CIH時間的延長,神經(jīng)元細(xì)胞逐漸出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變,4W組細(xì)胞核仁濃縮,形態(tài)不規(guī)則。8W組細(xì)胞核內(nèi)開始出現(xiàn)的空泡,并逐漸增大。10W組細(xì)胞核內(nèi)形成典型的空泡征象,并且周圍伴有炎性細(xì)胞浸潤。這說明隨著CIH時間的延長,神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的損傷,細(xì)胞水腫,病理改變逐漸加重且累及損傷神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量逐漸增多;TUNEL染色結(jié)果顯示與同周齡常氧對照組相比,CIH組表達(dá)陽性凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增加(P0.05),且分布廣泛,凋亡程度隨CIH時間延長而加重,組間比較,有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);同樣我們也能夠觀察到隨著CIH時間的延長,星形膠質(zhì)細(xì)胞逐漸出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變,表現(xiàn)出胞體增大,足突增粗等典型的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生的特征,進(jìn)一步通過半定量分析,證實GFAP表達(dá)水平隨著CIH時間的延長而表達(dá)量明顯增高,與對照組相比,4W、8W、10W組均有明顯增高(P0.05),且組間比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2、p38MAPK信號通路和AQP4參與了姜黃素對CIH誘導(dǎo)腦損傷的保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制姜黃素干預(yù)組明顯改善CIH小鼠的一般狀態(tài),體重的延遲增長,同時下調(diào)了血清皮質(zhì)酮濃度,腦組織炎癥因子TNF-α及IL1-β表達(dá)及降低了腦濕干比重,且中,高劑量組效果更明顯,具有量效關(guān)系。我們也觀察到姜黃素減輕了腦皮質(zhì),腦干及小腦各部位神經(jīng)元的損傷及凋亡,抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生及AQP4表達(dá)上調(diào),且上述改變與姜黃素的劑量具有一定的量效關(guān)系。Western Blot結(jié)果提示CIH組可明顯上調(diào)小鼠腦組織中MKK3,MKK6,p38MAPK的磷酸化蛋白即p-p38MAPK,p-MKK3,p-MKK6表達(dá)水平,而p38MAPK,MKK3,MKK6的總蛋白水平各組間無顯著差異。姜黃素的干預(yù)(100 mg/kg、200mg/kg)可以抑制其磷酸化水平,表現(xiàn)為p-MKK3,p-MKK6,p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平下調(diào),且對姜黃素有一定的量效關(guān)系。通過免疫熒光染色我們也觀察到姜黃素高劑量治療組可以抑制在大腦皮質(zhì),小腦及腦干各部位CIH誘導(dǎo)的GFAP-AQP4,GFAP-p-p38MAPK共定位星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加。3、p38 MAPK/AQP4信號通路在低氧所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用及姜黃素的保護(hù)機(jī)制低氧條件下可誘發(fā)細(xì)胞上清液LDH濃度升高,而p38抑制劑組及姜黃素組均可以抑制細(xì)胞上清液中LDH濃度升高;低氧可以誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38MAPK表達(dá)上調(diào),p38MAPK抑制劑可以成功阻斷低氧誘發(fā)的p-p38MAPK表達(dá)上調(diào),而姜黃素也可以抑制低氧誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化水平,下調(diào)p-p38MAPK蛋白表達(dá)含量。同時我們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在低氧刺激下從蛋白和基因水平上可以上調(diào)AQP4表達(dá),而p38MAPK抑制劑成功阻斷低氧誘發(fā)的p-p38MAPK表達(dá)上調(diào)后,AQP4表達(dá)有所下降,說明在星形膠質(zhì)細(xì)胞上低氧刺激可以激活p38MAPK/AQP4通路。有趣的是,姜黃素干預(yù)后,也抑制了低氧狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞上p38MAPK磷酸化水平及AQP4表達(dá),這提示姜黃素可能通過抑制p38MAPK/AQP4通路減輕了低氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。而在常氧對照組,常氧姜黃素組及常氧p38抑制劑組各項指標(biāo)均無明顯變化。結(jié)論:1、CIH可以誘導(dǎo)小鼠的應(yīng)激狀態(tài)(體重增長遲緩,血清皮質(zhì)酮濃度升高),慢性炎癥損傷(腦組織炎癥因子表達(dá)TNF-α,IL1-β上調(diào),腦水腫)及腦組織結(jié)構(gòu)性的改變(神經(jīng)元的損傷和凋亡、星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生),并且隨著CIH時間的延長呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢。2、姜黃素可以通過降低CIH誘導(dǎo)的小鼠應(yīng)激狀態(tài),緩解腦組織的慢性炎癥損傷,減輕腦組織的結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而發(fā)揮了一定的保護(hù)作用,并且這種保護(hù)作用體現(xiàn)在大腦皮質(zhì),小腦及腦干多部位,并且姜黃素存在一定的量效關(guān)系。3、姜黃素對CIH誘導(dǎo)腦損傷的保護(hù)作用與抑制p38MAPK信號通路活性及下調(diào)AQP4表達(dá)有關(guān)。體外實驗驗證了姜黃素通過抑制p38MAPK/AQP4通路減輕了低氧誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷,從而推測姜黃素對CIH小鼠腦損傷的保護(hù)作用部分可能是通過抑制了p38MAPK/AQP4通路的活性來實現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R766;R741

【參考文獻(xiàn)】

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1 李婷;王瑋;孔德磊;蘇皎;康健;;間歇低氧對大鼠頦舌肌運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)經(jīng)顱磁刺激反應(yīng)的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2012年04期

本文編號：2822331