甲狀腺相關(guān)眼病(Thyroid-associated ophthalmopathy,TAO),又稱Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO),是一種復(fù)雜的自身特異性免疫性疾病,與Graves病(Graves disease,GD)密切相關(guān),是GD最常見、最重要的甲狀腺外器官損害。它具有毀容性和潛在的致盲性,最終導(dǎo)致眼眶組織重塑和鄰近眼球結(jié)構(gòu)功能的破壞。其確切發(fā)病機(jī)制尚不清。目前臨床上對TAO的治療尚無特異性的治療方法。胰島素樣生長因子-1受體(Insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)和促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)是目前研究較為廣泛的與TAO相關(guān)的兩種自身抗原。眼眶成纖維細(xì)胞(Orbital fibroblasts,OFs)表達(dá)胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R),TSHR抗體免疫沉淀復(fù)合物可以有效地作用在IGF-1R,與IGF-1R形成物理和功能信號傳導(dǎo)復(fù)合物。一些研究表明,抑制IGF-1R活性導(dǎo)致在任一受體處起始的信號傳導(dǎo)的減弱。這些實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果作為最近完成的一種靶向作用于TAO中IGF-1R的單克隆抑制性抗體teprotumumab治療試驗(yàn)的基本原理提供了依據(jù)。該單克隆抗體teprotumumab在降低活動(dòng)性,中度至重度TAO的臨床活動(dòng)評分(Clinical activity score,CAS),突眼和復(fù)視方面是有效的,其試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞。近年來的的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)IGF-1R在TAO的發(fā)病中起了很關(guān)鍵的作用。miRNA-146a具有多個(gè)靶基因,為典型的多功能miRNA,在同一細(xì)胞通路中依據(jù)不同的條件,而發(fā)揮各自特征性的調(diào)節(jié)作用,參與免疫調(diào)控、細(xì)胞增殖分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)代謝等多種生命過程。前期我們的研究已發(fā)現(xiàn):miRNA-146a在TAO患者眼眶組織及外周血單核細(xì)胞(Peripheralblood mononuclear cells,PBMC)中低表達(dá),而在正常人眼眶組織中高表達(dá)。另外,IGF-1R是利用TargetScan 6.2進(jìn)行生物信息學(xué)分析揭示的miR-146a的靶標(biāo)(http://www.targetscan.org,發(fā)布日期為2012年6月)。本研究在上述研究背景條件下,對TAO的眼眶成纖維細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究。目的:我們將從miRNA這個(gè)新視點(diǎn)入手,探索miR-146a對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細(xì)胞形態(tài)影響和增殖的調(diào)控作用,并且闡明miRNA-146a在眼眶成纖維細(xì)胞中對IGF-IR和其下游分子Akt蛋白及相關(guān)炎性因子TNF-α的差異性表達(dá),為研究眼眶成纖維細(xì)胞在TAO的發(fā)病機(jī)制中起到一定的奠基作用。探索TAO在基因?qū)用娴陌l(fā)病機(jī)制,研究針對TAO的靶向治療藥物,為TAO的防治奠定基礎(chǔ)。方法:本研究設(shè)實(shí)驗(yàn)組(TAO,11例)和對照組(Control,8例)兩組。對11例接受眼眶減壓手術(shù)的甲狀腺功能亢進(jìn)性視神經(jīng)病變患者進(jìn)行了球后眼眶結(jié)締組織標(biāo)本的采集作為實(shí)驗(yàn)組。選取因眼外傷等原因引起眼球萎縮而需行眼球摘除+義眼座植入術(shù)的患者,且與實(shí)驗(yàn)組年齡,性別相匹配的8例作為對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組患者均無活動(dòng)性炎癥。選取眼眶球后組織用于眼眶成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)來源。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加入合適的含陰性對照組(Negative control,NC),miR-146a mimic(miR-146am),miR-146a-5p-inhibition(miR-146ai)的各組慢病毒,分別加入到實(shí)驗(yàn)組和對照組的各個(gè)孔。使用熒光顯微鏡檢測感染后的眼眶成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及形態(tài),用CCK-8分別檢測各組細(xì)胞的24h,48h,72h,96h的光密度值(optical density,OD),并計(jì)算眼眶成纖維細(xì)胞的細(xì)胞存活率(Cell viability)。我們通過組織提取和原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),然后傳代培養(yǎng),獲得相對純化的人眼眶成纖維細(xì)胞。純化后的人眼眶成纖維細(xì)胞經(jīng)鑒定后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染人眼眶成纖維細(xì)胞,過表達(dá)或抑制眼眶成纖維細(xì)胞miR-146a的表達(dá)水平后,將轉(zhuǎn)染成功后的眼眶成纖維細(xì)胞通過激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析眼眶成纖維細(xì)胞表面IGF-IR受體的定位和表達(dá),通過蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測miR-146a對成功轉(zhuǎn)染后的眼眶成纖維細(xì)胞中Akt蛋白表達(dá)的影響。最后通過ELISA法檢測轉(zhuǎn)染48h后眼眶成纖維細(xì)胞上清液中TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果:體外成功培養(yǎng)人眼眶球后組織原代眼眶成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行純化培養(yǎng)及鑒定眼眶成纖維細(xì)胞。然后將攜帶miR-146 mimic(miR-146a)或miR-146a inhibitor(miR-146ai)目的基因的慢病毒成功轉(zhuǎn)染到眼眶成纖維細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后眼眶成纖維細(xì)胞感染效率在80%以上,眼眶成纖維細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化,仍成長梭形或多角形。CCK-8結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染外源性miR-146am后,TAO組和對照組均能促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞的增殖,細(xì)胞存活率大于1,而miR-146ai則顯著抑制眼眶成纖維細(xì)胞的增殖,且細(xì)胞存活率小于1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)顯示,外源性的miR-146am使甲狀腺相關(guān)眼病中眼眶成纖維細(xì)胞表面的IGF-1R的表達(dá)減少,miR-146ai使眼眶成纖維細(xì)胞表面的IGF-1R的表達(dá)增加,IGF-1R定位于眼眶成纖維細(xì)胞核周、胞質(zhì)及質(zhì)膜隔室。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。WB結(jié)果提示外源性miRNA-146am使甲狀腺相關(guān)眼病中眼眶成纖維細(xì)胞中Akt蛋白的表達(dá)減少(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA法檢測TAO組患者眼眶成纖維細(xì)胞48h上清液中TNF-α水平明顯升高,結(jié)果與正常組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞中,miR-146am組TNF-α水平下降(P0.05),同時(shí)miR-146ai組水平升高(P0.05)。在正常人眼眶成纖維細(xì)胞,miR-146ai組的TNF-a水平升高(P0.05),miR-146am組TNF-a水平與Control-NC沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:外源性miR-146am對人眼眶成纖維細(xì)胞形態(tài)變化無明顯影響,而對人OFs的增殖具有明顯促進(jìn)作用。外源性miR-146am抑制甲狀腺相關(guān)眼病中眼眶成纖維細(xì)胞表面的IGF-1R和Akt蛋白的表達(dá),miR-146ai則是促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞IGF-1R和Akt的表達(dá)。該作用說明IGF-1R/Akt可能是TAO發(fā)展的重要通路,外源性miR-146am可能通過IGF-1R/Akt通路影響TAO的發(fā)展。IGF-1R在TAO眼眶成纖維細(xì)胞中表達(dá),IGF-1R是眼眶成纖維細(xì)胞的信號傳導(dǎo)分子,而Akt分子作為已知的IGF-1R信號通路上重要的下游分子,可能導(dǎo)致透明質(zhì)酸或者相關(guān)炎性因子的變化,可能與TAO的發(fā)生發(fā)展的有關(guān)。研究miR-146a對眼眶成纖維細(xì)胞IGF-1R/Akt的影響,可能對抑制TAO局部的細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)有一定作用,但可能有不同的通路,尚需要我們進(jìn)一步研究。對于了解TAO的發(fā)病機(jī)制和特異性治療方法的發(fā)展具有重要意義,這可能成為TAO治療的新途徑。此外,外源性miR-146am可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中TNF-α的表達(dá),同時(shí)miR-146ai可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)。miR-146a對炎癥反應(yīng)具有積極作用。研究miR-146a對眼眶成纖維細(xì)胞的增殖反應(yīng)、相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)及炎性反應(yīng)因子的作用,對于了解TAO的發(fā)病機(jī)制和特異性治療方法的發(fā)展具有重要意義。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R581;R771.3
【部分圖文】：

36圖 1-1 轉(zhuǎn)染后 5 天后的眼眶成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率（×40倍），標(biāo)尺=200μmFigure 1-1 Transfection rate of orbital fibroblasts 5 days after transfection (×40), Scale bar=200μm

圖 1-2 轉(zhuǎn)染后 5 天后眼眶成纖維細(xì)胞的形態(tài), 標(biāo)尺=100μm（×100 倍）Figure1-2 5 days after transfection. Cell morphology, Scale bar=100μm(×100)3.2 CCK-8 檢測 miR-146a 對眼眶成纖維細(xì)胞增殖的影響miR-146a 對人類甲狀腺相關(guān)眼病的眼眶成纖維細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用：miR-146a 的表達(dá)在與免疫和增殖失調(diào)的相關(guān)疾病中受到調(diào)節(jié)，并在過度分化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，miR-146a 在 TAO 眼眶成纖維細(xì)胞中與增殖相關(guān)的研究仍然知之甚少。因此，我們檢測了對照組（n = 8）或TAO（n = 11）組織中眼眶成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-146a 后，眼眶成纖維細(xì)胞的增殖情況。在眼眶成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-146am 和 miR-146ai 后 24 小時(shí)，48 小時(shí)，72 小時(shí)和 96 小時(shí)用 CCK-8 試劑盒測量細(xì)胞增殖。采用重復(fù)測量單因素方差分析，兩兩比較結(jié)果顯示如圖 1-3，轉(zhuǎn)染 miR-146am 后，

39-3 其中 A 代表細(xì)胞 24h、48h、72h、96h 增殖情況（OD）;B 代表細(xì)胞轉(zhuǎn)染后存活率（%）；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后存活率柱狀圖（%）（*<0.05,***<0.001）re 1-3 A represents cell proliferation (OD); B represents cell viability after transfection (%); esents histogram after cell transfection (%)（*<0.05,***<0.001） miR-146a 對眼眶成纖維細(xì)胞中 IGF-1R 的調(diào)控作用外源性 miR-146a 抑制眼眶成纖維細(xì)胞中 IGF-1R 的表達(dá)：如前面實(shí)驗(yàn)驟所述，將 miR-146a 成功轉(zhuǎn)染到眼眶成纖維細(xì)胞中。此后正常更換培

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本文編號：2815865