甲狀腺相關(guān)眼病(Thyroid-associated ophthalmopathy,TAO),又稱Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO),是一種復(fù)雜的自身特異性免疫性疾病,與Graves病(Graves disease,GD)密切相關(guān),是GD最常見、最重要的甲狀腺外器官損害。它具有毀容性和潛在的致盲性,最終導(dǎo)致眼眶組織重塑和鄰近眼球結(jié)構(gòu)功能的破壞。其確切發(fā)病機制尚不清。目前臨床上對TAO的治療尚無特異性的治療方法。胰島素樣生長因子-1受體(Insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)和促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)是目前研究較為廣泛的與TAO相關(guān)的兩種自身抗原。眼眶成纖維細胞(Orbital fibroblasts,OFs)表達胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R),TSHR抗體免疫沉淀復(fù)合物可以有效地作用在IGF-1R,與IGF-1R形成物理和功能信號傳導(dǎo)復(fù)合物。一些研究表明,抑制IGF-1R活性導(dǎo)致在任一受體處起始的信號傳導(dǎo)的減弱。這些實驗研究結(jié)果作為最近完成的一種靶向作用于TAO中IGF-1R的單克隆抑制性抗體teprotumumab治療試驗的基本原理提供了依據(jù)。該單克隆抗體teprotumumab在降低活動性,中度至重度TAO的臨床活動評分(Clinical activity score,CAS),突眼和復(fù)視方面是有效的,其試驗結(jié)果令人鼓舞。近年來的的動物模型實驗也進一步證實IGF-1R在TAO的發(fā)病中起了很關(guān)鍵的作用。miRNA-146a具有多個靶基因,為典型的多功能miRNA,在同一細胞通路中依據(jù)不同的條件,而發(fā)揮各自特征性的調(diào)節(jié)作用,參與免疫調(diào)控、細胞增殖分化、凋亡、細胞外基質(zhì)代謝等多種生命過程。前期我們的研究已發(fā)現(xiàn):miRNA-146a在TAO患者眼眶組織及外周血單核細胞(Peripheralblood mononuclear cells,PBMC)中低表達,而在正常人眼眶組織中高表達。另外,IGF-1R是利用TargetScan 6.2進行生物信息學(xué)分析揭示的miR-146a的靶標(biāo)(http://www.targetscan.org,發(fā)布日期為2012年6月)。本研究在上述研究背景條件下,對TAO的眼眶成纖維細胞進行相關(guān)基礎(chǔ)研究。目的:我們將從miRNA這個新視點入手,探索miR-146a對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細胞形態(tài)影響和增殖的調(diào)控作用,并且闡明miRNA-146a在眼眶成纖維細胞中對IGF-IR和其下游分子Akt蛋白及相關(guān)炎性因子TNF-α的差異性表達,為研究眼眶成纖維細胞在TAO的發(fā)病機制中起到一定的奠基作用。探索TAO在基因?qū)用娴陌l(fā)病機制,研究針對TAO的靶向治療藥物,為TAO的防治奠定基礎(chǔ)。方法:本研究設(shè)實驗組(TAO,11例)和對照組(Control,8例)兩組。對11例接受眼眶減壓手術(shù)的甲狀腺功能亢進性視神經(jīng)病變患者進行了球后眼眶結(jié)締組織標(biāo)本的采集作為實驗組。選取因眼外傷等原因引起眼球萎縮而需行眼球摘除+義眼座植入術(shù)的患者,且與實驗組年齡,性別相匹配的8例作為對照組。實驗組和對照組患者均無活動性炎癥。選取眼眶球后組織用于眼眶成纖維細胞的原代培養(yǎng)來源。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果加入合適的含陰性對照組(Negative control,NC),miR-146a mimic(miR-146am),miR-146a-5p-inhibition(miR-146ai)的各組慢病毒,分別加入到實驗組和對照組的各個孔。使用熒光顯微鏡檢測感染后的眼眶成纖維細胞的轉(zhuǎn)染效率及形態(tài),用CCK-8分別檢測各組細胞的24h,48h,72h,96h的光密度值(optical density,OD),并計算眼眶成纖維細胞的細胞存活率(Cell viability)。我們通過組織提取和原代細胞培養(yǎng)技術(shù),然后傳代培養(yǎng),獲得相對純化的人眼眶成纖維細胞。純化后的人眼眶成纖維細胞經(jīng)鑒定后用于后續(xù)實驗。利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染人眼眶成纖維細胞,過表達或抑制眼眶成纖維細胞miR-146a的表達水平后,將轉(zhuǎn)染成功后的眼眶成纖維細胞通過激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞術(shù)分析眼眶成纖維細胞表面IGF-IR受體的定位和表達,通過蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測miR-146a對成功轉(zhuǎn)染后的眼眶成纖維細胞中Akt蛋白表達的影響。最后通過ELISA法檢測轉(zhuǎn)染48h后眼眶成纖維細胞上清液中TNF-α的表達水平。結(jié)果:體外成功培養(yǎng)人眼眶球后組織原代眼眶成纖維細胞,并進行純化培養(yǎng)及鑒定眼眶成纖維細胞。然后將攜帶miR-146 mimic(miR-146a)或miR-146a inhibitor(miR-146ai)目的基因的慢病毒成功轉(zhuǎn)染到眼眶成纖維細胞中。轉(zhuǎn)染后眼眶成纖維細胞感染效率在80%以上,眼眶成纖維細胞形態(tài)未見明顯變化,仍成長梭形或多角形。CCK-8結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染外源性miR-146am后,TAO組和對照組均能促進眼眶成纖維細胞的增殖,細胞存活率大于1,而miR-146ai則顯著抑制眼眶成纖維細胞的增殖,且細胞存活率小于1。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞術(shù)顯示,外源性的miR-146am使甲狀腺相關(guān)眼病中眼眶成纖維細胞表面的IGF-1R的表達減少,miR-146ai使眼眶成纖維細胞表面的IGF-1R的表達增加,IGF-1R定位于眼眶成纖維細胞核周、胞質(zhì)及質(zhì)膜隔室。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。WB結(jié)果提示外源性miRNA-146am使甲狀腺相關(guān)眼病中眼眶成纖維細胞中Akt蛋白的表達減少(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。ELISA法檢測TAO組患者眼眶成纖維細胞48h上清液中TNF-α水平明顯升高,結(jié)果與正常組相比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在TAO患者眼眶成纖維細胞中,miR-146am組TNF-α水平下降(P0.05),同時miR-146ai組水平升高(P0.05)。在正常人眼眶成纖維細胞,miR-146ai組的TNF-a水平升高(P0.05),miR-146am組TNF-a水平與Control-NC沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:外源性miR-146am對人眼眶成纖維細胞形態(tài)變化無明顯影響,而對人OFs的增殖具有明顯促進作用。外源性miR-146am抑制甲狀腺相關(guān)眼病中眼眶成纖維細胞表面的IGF-1R和Akt蛋白的表達,miR-146ai則是促進眼眶成纖維細胞IGF-1R和Akt的表達。該作用說明IGF-1R/Akt可能是TAO發(fā)展的重要通路,外源性miR-146am可能通過IGF-1R/Akt通路影響TAO的發(fā)展。IGF-1R在TAO眼眶成纖維細胞中表達,IGF-1R是眼眶成纖維細胞的信號傳導(dǎo)分子,而Akt分子作為已知的IGF-1R信號通路上重要的下游分子,可能導(dǎo)致透明質(zhì)酸或者相關(guān)炎性因子的變化,可能與TAO的發(fā)生發(fā)展的有關(guān)。研究miR-146a對眼眶成纖維細胞IGF-1R/Akt的影響,可能對抑制TAO局部的細胞增殖和炎癥反應(yīng)有一定作用,但可能有不同的通路,尚需要我們進一步研究。對于了解TAO的發(fā)病機制和特異性治療方法的發(fā)展具有重要意義,這可能成為TAO治療的新途徑。此外,外源性miR-146am可抑制眼眶成纖維細胞中TNF-α的表達,同時miR-146ai可促進眼眶成纖維細胞中TNF-α的表達。miR-146a對炎癥反應(yīng)具有積極作用。研究miR-146a對眼眶成纖維細胞的增殖反應(yīng)、相關(guān)信號通路蛋白的表達及炎性反應(yīng)因子的作用,對于了解TAO的發(fā)病機制和特異性治療方法的發(fā)展具有重要意義。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R581;R771.3
【部分圖文】：

36圖 1-1 轉(zhuǎn)染后 5 天后的眼眶成纖維細胞的轉(zhuǎn)染率（×40倍），標(biāo)尺=200μmFigure 1-1 Transfection rate of orbital fibroblasts 5 days after transfection (×40), Scale bar=200μm

圖 1-2 轉(zhuǎn)染后 5 天后眼眶成纖維細胞的形態(tài), 標(biāo)尺=100μm（×100 倍）Figure1-2 5 days after transfection. Cell morphology, Scale bar=100μm(×100)3.2 CCK-8 檢測 miR-146a 對眼眶成纖維細胞增殖的影響miR-146a 對人類甲狀腺相關(guān)眼病的眼眶成纖維細胞增殖具有促進作用：miR-146a 的表達在與免疫和增殖失調(diào)的相關(guān)疾病中受到調(diào)節(jié)，并在過度分化的進展中發(fā)揮重要作用。然而，miR-146a 在 TAO 眼眶成纖維細胞中與增殖相關(guān)的研究仍然知之甚少。因此，我們檢測了對照組（n = 8）或TAO（n = 11）組織中眼眶成纖維細胞轉(zhuǎn)染 miR-146a 后，眼眶成纖維細胞的增殖情況。在眼眶成纖維細胞中轉(zhuǎn)染 miR-146am 和 miR-146ai 后 24 小時，48 小時，72 小時和 96 小時用 CCK-8 試劑盒測量細胞增殖。采用重復(fù)測量單因素方差分析，兩兩比較結(jié)果顯示如圖 1-3，轉(zhuǎn)染 miR-146am 后，

39-3 其中 A 代表細胞 24h、48h、72h、96h 增殖情況（OD）;B 代表細胞轉(zhuǎn)染后存活率（%）；細胞轉(zhuǎn)染后存活率柱狀圖（%）（*<0.05,***<0.001）re 1-3 A represents cell proliferation (OD); B represents cell viability after transfection (%); esents histogram after cell transfection (%)（*<0.05,***<0.001） miR-146a 對眼眶成纖維細胞中 IGF-1R 的調(diào)控作用外源性 miR-146a 抑制眼眶成纖維細胞中 IGF-1R 的表達：如前面實驗驟所述，將 miR-146a 成功轉(zhuǎn)染到眼眶成纖維細胞中。此后正常更換培

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本文編號：2815865