【摘要】：角膜位于眼球最前端，占有眼球2/3的屈光度。角膜是透明的，具有層狀結(jié)構(gòu)。角膜透明是由于基質(zhì)膠原纖維的特殊排列和沒有血管。由于沒有血管，角膜和臨近組織中促血管生成因子和抗血管生成因子的動(dòng)態(tài)平衡，保持角膜無血管生成，使其為免疫赦免器官。幾類因素可能觸發(fā)此種平衡失衡，促血管發(fā)生和/或抗血管生成因子降低，導(dǎo)致角膜新生血管。形成角膜新生血管（cornealneovascularization, CNV）的原因可以是先天性的，如無虹膜；或獲得的，如外傷，感染，炎癥，變性等，這些因素通過不同機(jī)制誘導(dǎo)新血管形成，大多數(shù)包括缺氧，炎癥和角膜緣干細(xì)胞缺乏等。時(shí)至今日，CNV確切的機(jī)制尚不清楚，然而，幾種炎癥介導(dǎo)因子和生長(zhǎng)因子進(jìn)入人們視線，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）家族是新血管形成和生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一。VEGF分為幾種亞型因子，VEGF-A在血管生成中是最重要的。負(fù)責(zé)血管生成的其他因素，包括血小板衍生的生長(zhǎng)因子（PDGF），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），某些白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子等。它們的作用仍然是不明確的�；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以破壞細(xì)胞外基質(zhì)，并促進(jìn)生成新血管。MMP-2和MMP-9在角膜新生血管向內(nèi)生長(zhǎng)中起重要作用，可作為治療靶點(diǎn)。 全世界約有一千萬人因角膜原因失明，是繼白內(nèi)障后的第二個(gè)可逆性失明的常見原因。由于生活、衛(wèi)生條件差和治療費(fèi)用昂貴等原因，角膜失明是在發(fā)展中國(guó)家更為常見。與視網(wǎng)膜變性和青光眼等疾病不同，角膜失明是可以預(yù)防的，大多數(shù)都是可逆的。改進(jìn)已有治療方法和研究新的治療手段可有效減少因角膜失明的患者。此外提高人群受教育程度，改進(jìn)生活條件將減少因角膜受累而失明的概率。 臨床用于CNV的療法分為兩類：藥物治療和手術(shù)治療。藥物包括類固醇或非類固醇消炎藥物。近期，抗VEGF因子在治療眼部新生血管中得到廣泛應(yīng)用，包括CNV的治療，收到了良好的治療效果，但許多國(guó)家尚未批準(zhǔn)應(yīng)用此類藥物。一些生物材料治療和基因治療在實(shí)驗(yàn)中展開，但尚未應(yīng)用到臨床。手術(shù)治療包括激光光凝，光動(dòng)力療法，電凝固術(shù)和移植療法。移植物包括角膜的全層或單層，羊膜，結(jié)膜，種植口腔粘膜上皮片或角膜緣干細(xì)胞。角膜緣干細(xì)胞移植主要用于角膜緣干細(xì)胞缺乏和角膜新生血管的治療，有較高成功率。第一次開展角膜緣干細(xì)胞移植手術(shù)是將來自健眼的角膜緣小片移植到對(duì)側(cè)傷眼切口處�，F(xiàn)在這種技術(shù)經(jīng)改善后已經(jīng)實(shí)施，包括角膜緣干細(xì)胞擴(kuò)增和借助羊膜，生物支架載體或隱形眼鏡等進(jìn)行移植，臨床試驗(yàn)已對(duì)此項(xiàng)技術(shù)的安全性，可行性和有效性進(jìn)行調(diào)查。 角膜緣干細(xì)胞移植治療CNV雖是一種有效方法，但仍有許多弊端，如：需手術(shù)才可得到角膜緣小片，所以有炎癥和感染等并發(fā)癥；很多眼部新生血管是雙側(cè)發(fā)病，得到有用的角膜緣小片組織十分困難。而異體移植又有高免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，尤其對(duì)于免疫赦免已經(jīng)破壞的角膜。由于以上諸多原因，大家不斷提出新的治療方案，干細(xì)胞移植可能是其中最適合有效的方法。 干細(xì)胞是具有自我更新和分化能力的細(xì)胞。主要有三種類型：胚胎干細(xì)胞（ESC），成體干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPS）。IPS和ESC生長(zhǎng)較快，多潛能，在適當(dāng)?shù)拇碳l件下可以分化為多種細(xì)胞，但由于許多實(shí)際問題，限制在臨床使用。如：倫理問題，免疫排斥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)高。對(duì)比ESC和iPS，MSCs是一種在體外分離培養(yǎng)簡(jiǎn)單，再生能力強(qiáng)，腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)低，不面臨倫理問題，更適合于干細(xì)胞治療。已經(jīng)有許多研究表明，這些細(xì)胞具有良好的可塑性，致瘤率低。因此，它們更適用于移植治療。間充質(zhì)干細(xì)胞可以從多種器官和組織中分離出來，如：骨髓，脂肪組織，牙齒和羊水，臍帶，胎盤等。最常使用的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）。它們具有以下特征：從骨髓中分離，貼壁生長(zhǎng)，紡錘形細(xì)胞，表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105，CD90，CD29，不表達(dá)CD31，CD45，CD11b等。MSCs可提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，但其整合和分化的能力始終還面臨問題。BMSCs適宜自體移植。最近的研究表明，骨BMSCs不表達(dá)MHC II類抗原，共刺激分子CD80，CD84或CD40和僅表達(dá)少量MHC I類抗原，因此，他們可以對(duì)接受者免疫系統(tǒng)是無形的。這使干細(xì)胞在自體和異體移植中廣泛應(yīng)用。MSC本身還通過抑制T細(xì)胞，B細(xì)胞和NK細(xì)胞活性抑制免疫系統(tǒng)。 從脂肪組織，臍帶，羊水和骨髓衍生的MSC顯示出大致相同的特性，所以細(xì)胞移植可以從醫(yī)療廢物（吸脂，胎盤，臍帶（UC）和分娩后羊水）獲得，并安全地用于自體移植。 2005-2006年有報(bào)告使用MSCs治療角膜新生血管。在此之后，許多研究團(tuán)隊(duì)開始探討充質(zhì)干細(xì)胞在角膜傷口愈合和角膜血管生成中的作用。至少有35篇發(fā)表的報(bào)告出現(xiàn)。所有發(fā)表的論文均報(bào)告間充質(zhì)干細(xì)胞有利于角膜傷口愈合和減少角膜上皮修復(fù)時(shí)間。 研究目的： 進(jìn)一步研究骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞在角膜新生血管形成和傷口愈合中的作用，并比較不同治療途徑的可行性和有效性。 材料和方法： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自8日齡Wistar大鼠，體外培養(yǎng)，分離。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志物。第二或第三代細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記。在健康孕婦在知情同意后，獲得人羊膜。通過化學(xué)和機(jī)械方法去除上皮層得到（denuded human amniotic membranes，d-HAM)，BMSCs接種到d-HAM上。共36只雌性Wistar大鼠利用化學(xué)傷害誘導(dǎo)法建立角膜新生血管動(dòng)物模型。動(dòng)物右眼角膜的中心浸泡在被1mol/L的氫氧化鈉水溶液（NaOH）浸濕的直徑3mm濾紙30秒，接著用60ml無菌鹽水對(duì)角膜徹底沖洗1分鐘。七天后大鼠隨機(jī)分為三組：第一組接受結(jié)膜下注射溶于PBS中的BMSCs，第二組接受接種BMSCs的D-HAM移植，第三組未接受治療，作為對(duì)照組。角膜上皮缺損面積，基質(zhì)水腫和沉著混濁形成，新生血管面積用于評(píng)價(jià)角膜損傷。每天利用直接檢眼鏡并每周通過裂隙燈觀察。四個(gè)星期后處死動(dòng)物。每組五個(gè)角膜用于墨汁灌注后鋪片，圖片進(jìn)行特殊軟件處理，計(jì)算新生血管總長(zhǎng)度。每組四個(gè)角膜提取RNA，利用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Q-PCR）檢測(cè)VEGF-A的，MMP9， TLR-2和TLR-4表達(dá)量。各組中兩個(gè)角膜通過酶聯(lián)免疫分析（ELISA）用于VEGF的檢測(cè)，每組中的一個(gè)角膜，做冷凍切片，用于進(jìn)一步的組織病理學(xué)和對(duì)VEGF和MMP9的免疫染色。 結(jié)果： 48h后，分離培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞清晰可見。傳代至第二代和第三代顯示間充質(zhì)干細(xì)胞的典型特征：貼壁生張，紡錘狀，流式細(xì)胞術(shù)顯示CD90和CD44的陽(yáng)性表達(dá)， CD45和CD11b不表達(dá)。細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)GFP慢病毒，倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞呈綠色熒光。通過DAPI染色和激光共聚焦顯微鏡證實(shí)羊膜上皮層已剝脫。同樣證實(shí)BMSCs可在D-HAM成長(zhǎng)。 大鼠造模七天后檢查可見角膜混濁，新生血管生長(zhǎng)，并用熒光染料證實(shí)上皮缺損。檢測(cè)每個(gè)組損傷程度，單因素方差分析結(jié)果顯示組（P=103，CI95％）無顯著區(qū)別。四星期后得到的結(jié)果，通過ANOVA再次進(jìn)行比較。該分析顯示，組（P=0.002，CI=95％），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，差異在1組和2組，1組和3組和之間。2組和3組之間沒有顯著差異。因此，單一結(jié)膜下注射BMSCs與使用羊膜作為載體移植BMSCs相比，前者對(duì)角膜傷口愈合的影響更大。 墨汁灌注圖片表明，第2組和第3組與第1組相比，新生血管區(qū)域和長(zhǎng)度更加明顯（P=0.01，CI為95％）。用角膜部分H-E染色顯示，第1組角膜變薄，基質(zhì)緊湊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，上皮層完全康復(fù)。DAPI和抗VEGF和抗MMP9抗體免疫染色無明顯表達(dá)。ELISA試劑盒用于半定量檢測(cè)VEGF。Q-PCR檢測(cè)VEGF，MMP9和TLR2和TLR4。統(tǒng)計(jì)分析表明，各因素組間有差異，但僅限于VEGF的表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.03，CI=95％）。 討論： 角膜病致盲，是可逆性致盲眼病中第二常見原因，世界范圍內(nèi)對(duì)社會(huì)的經(jīng)濟(jì)和心理產(chǎn)生影響。數(shù)百萬計(jì)的患者都是雙側(cè)角膜受累致盲，發(fā)展中國(guó)家人數(shù)比例更多。然而角膜失明即使在發(fā)達(dá)國(guó)家也十分嚴(yán)重。許多國(guó)際組織，包括世界衛(wèi)生組織（WHO）都已提出改善這種情況戰(zhàn)略。 研究者正改善目前的治療方式和并尋找新的治療方法。其中包括在角膜新生血管治療中應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞。許多團(tuán)體都已開展這項(xiàng)治療，報(bào)告了滿意的效果。我們研究的目的是為了進(jìn)一步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)角膜新生血管的作用，并以比較幾個(gè)不同移植途徑的效果。 我們利用化學(xué)燒傷角膜造模，單純結(jié)膜下注射BMSCs和以裸露羊膜為載體，接種BMSCs后移植相比較，之前無相關(guān)報(bào)告的。我們的主要評(píng)估細(xì)胞移植后臨床效果及其對(duì)新生血管形成的影響。 我們的研究表明，移植干細(xì)胞可增強(qiáng)角膜傷口愈合和減少新生血管生成。令人驚奇的是，簡(jiǎn)單結(jié)膜下注射的BMSCs與羊膜接種干細(xì)胞移植相比，前者更有效。我們分析，這種差異可能是因?yàn)檠蚰ご嬖谟诮悄け砻妫?天后大多數(shù)羊膜已溶解消失，不能作為干細(xì)胞的載體繼續(xù)發(fā)揮作用，所以干細(xì)胞失去載體后不能持久的固定在眼表上，故不能繼續(xù)發(fā)揮作用。 干細(xì)胞是否分化為角膜細(xì)胞不是我們的此次研究的重點(diǎn)，我們雖然應(yīng)用慢病毒GFP標(biāo)記跟蹤移植細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。然而移植四個(gè)星期后，我們無法檢測(cè)到GFP標(biāo)記細(xì)胞，所以未發(fā)現(xiàn)角膜有任何移植細(xì)胞。所以BMSCs可能通過局部釋放營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)揮抗炎效果及抑制新生血管作用。結(jié)膜下注射后VEGF和MMP9的表達(dá)水平也表現(xiàn)出顯著降低。而對(duì)于TLR-2和TLR-4的差異不顯著，由于未見相關(guān)研究的報(bào)道，我們得出的結(jié)果可能與觀察的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。TLR是負(fù)責(zé)免疫反應(yīng)，其表達(dá)在炎癥開始的階段增加明顯。四周后的炎癥已在所有組中顯著降低，可能此時(shí)Toll樣受體的水平已降低到正常水平，所以我們未檢測(cè)到干細(xì)胞治療對(duì)它的具體影響。 結(jié)論： BMSCs移植能夠有效抑制角膜新生血管，單純結(jié)膜下注射BMSCs比羊膜接種BMSCs后移植更有效。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R772.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Ferda Alpaslan Pinarli;Gülsen 銉kten;

本文編號(hào)：2768646