【摘要】：目的:氧化應激是導致老年性白內(nèi)障產(chǎn)生的一個關(guān)鍵因素,人晶狀體上皮細胞(HLECs)易受氧化應激的影響,氧化損傷可以使晶狀體的混濁,最終引起白內(nèi)障。眾所周知,左旋肉堿(L-carnitine,LC)是人體必須的物質(zhì),在體內(nèi)和體外具備很強的抗氧化能力,廣泛分布于不同的生物體內(nèi),然而左旋肉堿對于HLECs氧化損傷的保護作用以及機制尚無統(tǒng)一的論斷。本研究旨在評估LC對HLECs氧化損傷的影響,而且討論左旋肉減(LC)對H2O2誘導的HLECs氧化損傷的保護作用及相關(guān)機制。方法:將HLE B-3細胞分為以下五組:(1)對照組:在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(2)氧化損傷組:除上述培養(yǎng)液外,加入H_2O_(2,)濃度為250μmol/L。(3)LC低濃度組:100μmol/L的LC預處理細胞16h,然后加入250μmol/L的H_2O_2處理24h,(4)LC中濃度組:300μmol/L的LC預處理細胞16h,然后加入250μmol/L的H_2O_2處理24h,(5)LC高濃度組:500μmol/L LC預處理細胞16h,加入250μmol/L的H_2O_2處理24h,所有細胞在用LC和H_2O_2處理前均用無血清的培養(yǎng)基饑餓處理8個小時。在LC預處理和不預處理的情況下,分別用含有過氧化氫(H_2O_2)的培養(yǎng)基培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞HLE B-3細胞,以探究LC對H_2O_2誘導的HLECs氧化應激的影響。用CCK-8法檢測細胞存活率,以評估細胞的增殖變化。按照公式計算,細胞存活率(%)=[(As-Ab)]/[(Ac-Ab)。其中,As是實驗組平均OD值,Ab為空白組平均OD值,AC為對照組的平均OD值。通過DCFH-DA染色檢測在過氧化氫和LC處理下,氧自由基(ROS)產(chǎn)生的量,以評估HLE B-3細胞的氧化應激狀態(tài)。通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和蛋白免疫印跡技術(shù)(Western-Blot)檢測氧化損傷標記物和抗氧化酶的表達水平,并且進一步研究LC對H_2O_2誘導的人晶狀體上皮細胞HLE B-3氧化損傷的保護作用及調(diào)控機制。結(jié)果:1.H_2O_2可顯著誘導人晶狀體上皮細胞HLE B-3細胞死亡,LC能夠顯著抑制由H_2O_2引起的人晶狀體上皮細胞HLE B-3細胞活力的降低。2.H_2O_2處理組HLE B-3細胞ROS顯著增多,但對于LC預處理組的HLE B-3細胞,ROS生成發(fā)生了明顯的下降。LC通過提高抗氧化酶FoxO1、PRDX4和CAT的表達從而降低ROS的生成。3.LC可以通過抑制Caspase3和IL-1等凋亡相關(guān)因子與炎癥因子的表達從而抑制過氧化氫誘導的細胞凋亡和炎癥反應。4.LC通過促進與增殖相關(guān)的因子如PCNA、CDK2、CDK4表達,從而恢復由雙氧水誘導的HLECs的增殖損傷。5.HLE B-3細胞中ROS累積可以誘導晶狀體上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),而經(jīng)過LC預處理后,能夠觀察到水通道蛋白(AQP1)和波形蛋白(Vimentin)的表達逆轉(zhuǎn),從而逆轉(zhuǎn)EMT。6.LC通過MAPK信號通路修復氧化/抗氧化失衡和細胞損傷。結(jié)論:LC擁有抑制HLE B-3細胞氧化損傷的保護性作用,或許可以成為一種預防和延緩白內(nèi)障的藥物。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R776.1
【圖文】：

在 LC 預處理 HLE B-3 細胞后，是否會逆轉(zhuǎn) H2O2對細胞的毒性作用。如圖1C 所示，與單獨 H2O2組相比，LC 預處理 16 小時后，對 HLE B-3 有顯著的保護作用，但其保護作用不是隨著藥物濃度的提高而提高的。當 LC 濃度為

圖 1：CCK-8 檢測 H2O2和 LC 對 HLEB-3 細胞活性的影響（n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, ns, no significant differences (P≥0.05)1.2.2 LC 可以逆轉(zhuǎn)由 H2O2誘導的 ROS 的生成。為了研究 LC 在 ROS 誘導的 HLE B-3 細胞氧化損傷中的作用，我們用 LC預處理 HLE B-3 細胞 16 小時后加入 250μmol/ L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)細胞 24 小時。如圖 2A 所示，H2O2處理組的 ROS 水平顯著高于對照組，但是加入 LC 預處理后，細胞的 ROS 水平顯著降低，并以濃度依賴性方式降低。以上結(jié)果表明 LC 可以抑制由 H2O2誘導的 HLE B-3 細胞中 ROS 的產(chǎn)生。

天津醫(yī)科大學碩士學位論文1.2.3 LC 可以促進抗氧化物的產(chǎn)生既然 LC 可以逆轉(zhuǎn)由 H2O2誘導的細胞中 ROS 的產(chǎn)生，那么，其潛在的分子機制變化仍需進一步探究。因此，我們考慮檢測在 LC 和 H2O2處理后，HLE B-3細胞中抗氧化物指標水平是否有變化。FoxO1、CAT 和 PRDX4 是有效的抗氧化物。如圖 3B 所示，與對照組相比，H2O2組 FoxO1、PRDX4 及 CAT mRNA 表達水平明顯降低，說明 H2O2處理可以使 HLE B-3 細胞中抗氧化物水平下降。而與H2O2處理組對比，LC 預處理組顯著提高了 Foxo1 基因 mRNA 水平，并且也增加了 PRDX4 和 CAT 的 mRNA 表達。同時， Western-Blot 結(jié)果從蛋白水平進一步證實了該結(jié)果，與陰性對照組相比，H2O2組 PRDX4 蛋白水平明顯下降，說明H2O2可以使細胞內(nèi)抗氧化物水平降低。而與 H2O2處理組比較，LC 預處理組PRDX4 蛋白表達明顯增加（圖 3C），這一結(jié)果表明 LC 可以通過促進抗氧化物的生成，逆轉(zhuǎn) H2O2產(chǎn)生的氧化損傷，從而對暴露于氧化損傷的 HLECs 起到一定的保護作用，減少氧化損傷。

【參考文獻】

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本文編號：2767790