發(fā)布時間：2020-07-07 14:05

【摘要】：真菌性角膜炎是全球發(fā)病率較高的致盲性眼病,而由于不同的菌種對抗真菌藥物的敏感性問題,至今沒有一種特別有效的根治該疾病的療治療方法和手段。動物機(jī)體本身對真菌感染存在著固有的免疫性應(yīng)答機(jī)制,以此來快速有效地識別病原體并抵抗病原入侵。不同細(xì)胞群體上存在著各種模式識別受體(PRRs)如C型凝集素受體(CTLRs)、Toll樣受體(TLRs)、RIG-1樣受體和含有Nod蛋白的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NLRs),它們可以識別真菌入侵者并觸發(fā)信號傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞反應(yīng)來消滅病原體。然而,以往的研究大多數(shù)是針對單個的受體因子來開展相關(guān)的探索,缺乏較為系統(tǒng)的真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)理的遺傳因素解析。因此,本課題基于構(gòu)建好的真菌性角膜炎模型,并利用高通量測序技術(shù)獲取相關(guān)樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息,通過大數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析篩選小鼠真菌性角膜炎發(fā)病過程中顯著性參與的差異表達(dá)基因集、信號通路以及關(guān)鍵因子的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:其一,我們成功地構(gòu)建了煙曲霉菌感染角膜組織的C57BL/6小鼠模型。38只小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為3組:1)空白組:5只小鼠的角膜不予任何干預(yù);2)對照組(PBS組):15只小鼠均在右眼角膜基質(zhì)內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液(PBS),左眼不予任何處理;3)實(shí)驗(yàn)組(S組):18只小鼠均在右眼角膜基質(zhì)內(nèi)注射孢子懸液,左眼不予任何處理。所有實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)培養(yǎng)5天。其二,分別選取PBS組實(shí)驗(yàn)小鼠角膜為對照組樣本PBS1,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)第2天小鼠角膜樣本為S2,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)第5天小鼠角膜樣本為S5作為實(shí)驗(yàn)樣本,通過RNA抽提、純化、建庫之后,采用第二代測序技術(shù)(Next-Generation Sequencing,NGS)基于Illumina HiSeq X10測序平臺,對這些文庫進(jìn)行雙末端(Paired-end,PE)測序。其三,對測序樣本和測序數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,獲取了每組樣本6G clean data的高通量測序數(shù)據(jù),并且三組樣本的測序數(shù)據(jù)Q20水平均達(dá)到95%以上,Q30水平均達(dá)到90%以上,基于主成分分析和樣品相關(guān)性檢驗(yàn)顯示三組測序樣本存在著明顯的異質(zhì)性,數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析的要求。其四,通過對PBS1組和S2組的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(S2組/PBS1組),并基于閾值標(biāo)準(zhǔn)即|log2FoldChange|1以及顯著性P-value0.05,我們篩選出了顯著性差異表達(dá)基因總數(shù)為646個,包括上調(diào)基因455個和下調(diào)基因191個,如上調(diào)基因Spdef和下調(diào)基因Galnt15;通過對S5組和S2組的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(S5組/S2組),我們篩選出了顯著性差異表達(dá)基因總數(shù)為739個,包括上調(diào)基因650個和下調(diào)基因89個,如上調(diào)基因Marco和下調(diào)基因Ccl4。不同時間點(diǎn)顯著性差異表達(dá)基因集比較結(jié)果顯示,在S2組/PBS組和S5組/S2組這兩種比較中均表現(xiàn)為下調(diào)的基因數(shù)為3個,包括Gldc、Aldh1a1和Ppp1r3c基因;在兩種比較中均表現(xiàn)為上調(diào)的基因數(shù)為49個,包括Casp12和Il1r2基因等。有意思的是,在S2組/PB組比較中表現(xiàn)為上調(diào)但在S5組/S2組比較中表現(xiàn)為下調(diào)的基因數(shù)為33個,包括Il1b基因等;在S2組/PBS組比較中表現(xiàn)為下調(diào)但在S5組/S2組比較中表現(xiàn)為上調(diào)的基因數(shù)為93個,包括Wnt5a基因等。大部分篩選的基因在以往的真菌性眼病或免疫學(xué)研究中有報道。其五,基于基因集富集分析方法,我們鑒定出了小鼠真菌性角膜炎發(fā)病過程的與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal Transduction)類別相關(guān)的信號通路。其中S2/PBS過程顯著性富集的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路包括TNF信號通路(FDR=2.32E-11)、NF-kappa B信號通路(FDR=2.66E-05)、PI3K-Akt信號通路(FDR=3.86E-05)、JAK-STAT信號通路(FDR=7.70E-05)、MAPK信號通路(FDR=2.03E-03)、Rap1信號通路(FDR=1.46E-02)和HIF-1信號通路(FDR=3.54E-02)。與之相比,Wnt信號通路(FDR=3.62E-02)、cGMP-PKG信號通路(FDR=4.10E-02)和Hippo信號通路(FDR=4.27E-02)特有地富集于真菌感染小鼠角膜的第五天。另外,我們基于白細(xì)胞介素-1β基因Il1b作為真菌性角膜炎小鼠基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵靶基因位點(diǎn)構(gòu)建了Card9-Casp1-Il1b調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用以解析小鼠真菌性角膜炎的發(fā)病機(jī)理,并針對C型凝集素受體信號通路基因(特別是Card9基因和炎癥細(xì)胞因子)在真菌性角膜炎模型中的表達(dá)模式進(jìn)行了探究。通過免疫熒光(Immunofluorescence,IF)實(shí)驗(yàn)和實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,Card9基因在三組樣本即PBS1組、S2組和S5組中的表達(dá)量均較低,三組比較言之,在真菌感染的第二天Card9基因表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢,而在真菌感染的第五天Card9基因表達(dá)量呈現(xiàn)一定的下降趨勢。綜上所述,基于高通量測序技術(shù)的真菌性角膜炎模型的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究為系統(tǒng)性解析真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)理提供了一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐,并可為其藥物治療提供更多的靶位點(diǎn),如Card9。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R772.21

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本文編號：2745205