【摘要】：背景和目的:視網(wǎng)膜變性(retinal degeneration,RD),包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)和年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration,AMD),是一類嚴(yán)重的致盲性眼病。其中RP的特征性病理改變是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium,RPE)進(jìn)行性的變性、凋亡和丟失~([1])。到目前為止,已有超過(guò)95種致病基因被證明可通過(guò)常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳參與RP的發(fā)病過(guò)程(https://sph.uth.edu/retnet)。RP的發(fā)病率在不同人群中不盡相同~([2])。目前對(duì)于RP尚無(wú)有效的治愈方法。據(jù)報(bào)道,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠在有限的時(shí)間內(nèi)挽救RPE和感光細(xì)胞使其免于凋亡,進(jìn)而延緩RP進(jìn)程~([3])。比如,視桿細(xì)胞源性視錐細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rod-derived cone viability factor,RdCVF)可減少P23H視網(wǎng)膜變性大鼠中視錐細(xì)胞的凋亡數(shù)量~([4])。此外,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)促進(jìn)RP進(jìn)程中RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞的凋亡~([5]),是RP病變的重要因素。因此,通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)或提供神經(jīng)保護(hù)作用,從而保護(hù)感光細(xì)胞免于凋亡可能是抑制RP病理進(jìn)程的重要手段。二甲雙胍是一種雙胍類的降糖藥,被廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病�，F(xiàn)有研究證實(shí)二甲雙胍在肥胖和腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮抗炎作用,從而產(chǎn)生有益作用~([6])。最近有報(bào)道稱,在3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(3,4-methylenedioxymethamphetamine,MDMA)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)變性和帕金森病~([7])中,二甲雙胍能發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。長(zhǎng)期使用二甲雙胍能夠通過(guò)降低AMP-活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)水平而降低中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)~([8]),證實(shí)了二甲雙胍具有神經(jīng)保護(hù)作用。二甲雙胍急性預(yù)處理被證明可通過(guò)預(yù)激活A(yù)MPK依賴性自噬,在局灶性腦缺血中發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用~([9])。在心臟驟停導(dǎo)致的缺血再灌注~([10])和全腦缺血~([11])中,二甲雙胍被發(fā)現(xiàn)可改善神經(jīng)功能,其作用機(jī)制與AMPK的調(diào)控有關(guān)。有研究證實(shí),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷和退行性病變中,二甲雙胍主要通過(guò)AMPK依賴性途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。眾所周知,AMPK是維持細(xì)胞能量產(chǎn)生和平衡的關(guān)鍵酶,而CNS利用的葡萄糖占全身總量的50%以上,可見(jiàn)AMPK在CNS的神經(jīng)功能維持和神經(jīng)元存活中尤為重要~([12])。近來(lái)有報(bào)道表明:二甲雙胍也有可能通過(guò)非AMPK依賴途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在QUIN誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性損傷的細(xì)胞模型中,二甲雙胍可抑制神經(jīng)元內(nèi)鈣的增加,減少細(xì)胞凋亡~([13])。在甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變大鼠模型中,二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3和CREB/BDNF信號(hào)通路產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用~([14])。這種機(jī)制在氧化應(yīng)激所致的PC12細(xì)胞損傷中也得到了證實(shí)~([15])。在氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中,二甲雙胍通過(guò)下調(diào)有絲分裂阻滯缺陷蛋白(mitotic arrest deficient 2-like protein 2,MAD2B)的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用~([16])。最近發(fā)現(xiàn),二甲雙胍通過(guò)清除淀粉樣蛋白斑塊沉積而改善APP/PS1阿爾茨海默病小鼠的記憶障礙~([17])。此外,二甲雙胍的這種非AMPK依賴的神經(jīng)保護(hù)作用也在大腦缺血模型中得到證實(shí)~([18])。到目前為止,二甲雙胍的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚未完全闡明。傳統(tǒng)的AMPK依賴機(jī)制有時(shí)是自相矛盾的。例如,在細(xì)胞模型和P23H這一RP大鼠模型中,二甲雙胍可改善RP模型P23H大鼠的視紫紅質(zhì)的運(yùn)輸,然而,由于二甲雙胍改善的P23H的視紫紅質(zhì)的不穩(wěn)定性,反而增加了感光細(xì)胞的死亡~([19])。除了P23H RP大鼠外,二甲雙胍在其他RP模型中的作用尚不清楚。B6.C3-Pde6brd1Hps4le(rd1)小鼠是快速視網(wǎng)膜光感受器變性的動(dòng)物模型,是由于視桿細(xì)胞中的cGMP磷酸二酯酶的β亞基(βsubunit of rod cGMP-phosphodiesterase,PDE6β)突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜中cGMP積累~([20]),最終引發(fā)嚴(yán)重的早發(fā)性視網(wǎng)膜變性~([21])。rd1小鼠中的突變基因與人類致病基因同源,因此已被用作研究人類RP的模型超過(guò)30年~([22,23])。本研究主要探究玻璃體腔注射二甲雙胍是否能夠保護(hù)rd1小鼠的感光細(xì)胞,改善視功能,延緩其變性進(jìn)程。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和分子生物學(xué)方法探索二甲雙胍對(duì)變性視網(wǎng)膜的作用機(jī)制,并采用離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。研究結(jié)果為探究RP的治療方法提供依據(jù)。方法:第一部分:玻璃體腔注射二甲雙胍對(duì)rd1小鼠視功能的影響1、出生后6天(P6)的rd1小鼠玻璃體腔注射二甲雙胍或磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS),同天齡的C57BL/6J(C57)小鼠作為對(duì)照。在P9、P12時(shí)重復(fù)注射,共三次。2、P14、P18、P22時(shí),用黑白箱行為學(xué)方法檢測(cè)小鼠視功能。3、P14、P18、P22時(shí),通過(guò)閃光視網(wǎng)膜電圖(flash electroretinogram,FERG)檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜功能。4、免疫組化檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)量,外核層(outer nuclear layer,ONL)厚度變化以及感光細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和雙極細(xì)胞的變化,并用蛋白印跡(western blot,WB)進(jìn)行驗(yàn)證。第二部分:二甲雙胍對(duì)rd1小鼠視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄組的影響1、將P14的rd1小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行RNA測(cè)序(RNA sequencing,RNA-seq),以檢測(cè)二甲雙胍對(duì)其變性視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄組的影響。2、根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析二甲雙胍延緩rd1小鼠視網(wǎng)膜變性的關(guān)鍵通路和基因。3、對(duì)測(cè)序篩選出的關(guān)鍵基因用RT-PCR驗(yàn)證,對(duì)核心基因——αA晶體蛋白用免疫組化和WB進(jìn)一步驗(yàn)證。第三部分:二甲雙胍對(duì)鈣超載所致類感光細(xì)胞損傷的作用1、體外培養(yǎng)類感光細(xì)胞系661W,對(duì)其進(jìn)行Ca~(2+)ionophore處理,制備鈣超載細(xì)胞損傷模型。2、CCK8實(shí)驗(yàn)和TUNEL染色檢測(cè)二甲雙胍處理對(duì)鈣超載的661W細(xì)胞活力和凋亡的影響。3、采用免疫熒光和WB技術(shù)檢測(cè)二甲雙胍處理對(duì)661W細(xì)胞中aA-晶體蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:第一部分:玻璃體腔注射二甲雙胍對(duì)rd1小鼠視功能的影響1、黑白箱行為學(xué)結(jié)果顯示,玻璃體腔注射二甲雙胍顯著延緩rd1小鼠視功能的下降,而對(duì)C57小鼠沒(méi)有明顯影響。FERG結(jié)果顯示玻璃體腔注射二甲雙胍使rd1小鼠b波幅值顯著升高,a波幅值在部分光強(qiáng)下顯著升高,對(duì)C57小鼠沒(méi)有明顯影響。2、免疫組化結(jié)果顯示,玻璃體腔注射二甲雙胍可顯著減少rd1小鼠視網(wǎng)膜中凋亡細(xì)胞的數(shù)量,明顯抑制外核層厚度變薄,而對(duì)C57小鼠無(wú)顯著影響。在rd1小鼠視網(wǎng)膜中二甲雙胍保護(hù)感光細(xì)胞,減少感光細(xì)胞凋亡,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,但是對(duì)雙極細(xì)胞沒(méi)有明顯影響。第二部分:二甲雙胍對(duì)rd1小鼠視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄組的影響1、RNA-seq結(jié)果顯示,二甲雙胍處理組和PBS處理組相比,共有337個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),其中上調(diào)的有291個(gè),下調(diào)的有46個(gè)。2、京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)途徑和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用分析的結(jié)果表明:細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用、TGF-β信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、凋亡通路和PI3K-Akt信號(hào)通路可能在二甲雙胍延緩rd1小鼠視網(wǎng)膜變性過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。晶體蛋白基因、凋亡相關(guān)基因(BIRC3,BIRC5和BAK1)和炎癥相關(guān)基因(IL4,IL10和TGFB1)可能是其中重要的靶基因。結(jié)合GO(Gene Ontology)分析結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能通過(guò)神經(jīng)保護(hù)、抗炎和抗凋亡作用保護(hù)rd1小鼠的視功能。免疫組化和WB結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)aA-晶體蛋白可能在二甲雙胍對(duì)rd1小鼠視網(wǎng)膜變性的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。第三部分:二甲雙胍對(duì)鈣超載所致類感光細(xì)胞損傷的作用1、二甲雙胍保護(hù)鈣超載所致的類感光細(xì)胞株661W細(xì)胞的損傷,顯著減少鈣超載造成的661W細(xì)胞凋亡。2、二甲雙胍處理后得到保護(hù)的661W細(xì)胞中αA-晶體蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)。結(jié)論:1、在rd1小鼠變性開(kāi)始之前,玻璃體腔注射二甲雙胍能夠顯著保護(hù)感光細(xì)胞,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,從而保護(hù)視功能,延緩視網(wǎng)膜色素變性進(jìn)程。2、二甲雙胍可能是通過(guò)上調(diào)晶體蛋白的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用,進(jìn)而延緩rd1小鼠視網(wǎng)膜變性的。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R774.13
【圖文】：
P12 時(shí)重復(fù)上述的操作。小鼠給藥及檢測(cè)流圖 3-1 小鼠給藥及檢測(cè)時(shí)間線箱行為學(xué)檢測(cè)相同液體（二甲雙胍或 PBS）的小鼠避光過(guò)黑白箱行為學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備（圖 3-2）。黑白為 30×30×40 cm3，暗室規(guī)格為 15×30×40 cm之間的間隔上開(kāi)設(shè) 10×10 cm2的開(kāi)口，小鼠可且光強(qiáng)為 300lux。
C57 小鼠在暗室的時(shí)間之間無(wú)顯著差異，提示二甲雙胍不影響正常小鼠 C57 的視覺(jué)功能（圖3-3 A）。和注射 PBS 的 C57 同齡小鼠相比，注射 PBS 的 rd1 小鼠在暗室中的時(shí)間明顯減少，而玻璃體腔注射二甲雙胍的 rd1 小鼠較注射 PBS 的 rd1 小鼠，在暗室中的時(shí)間顯著增加（P<0.01）。二甲雙胍的這一作用效果對(duì) P18 的 rd1 小鼠仍然保持（P<0.05）。而 P22 時(shí)，二甲雙胍延長(zhǎng) rd1 小鼠在暗室中時(shí)間的作用不再顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，在 P14 和 P18 時(shí)，二甲雙胍改善了 rd1 小鼠的視覺(jué)功能。然而，在 P22 時(shí)
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本文編號(hào)：2739063
